茯苓多糖抗氧化作用研究

卢华杰，卢燕，刘焱文

（湖北中医药大学药学院，湖北省中药资源与中药化学重点实验室，湖北武汉430061）

茯苓多糖抗氧化作用研究

卢华杰，卢燕，刘焱文*

（湖北中医药大学药学院，湖北省中药资源与中药化学重点实验室，湖北武汉430061）

比较研究茯苓水溶性多糖、酸性多糖及其不同酸度多糖的抗氧化作用，为茯苓多糖开发应用提供科学依据。采用水和1mol/LNaOH溶液分别提取得到茯苓水溶性多糖（PWP）及酸性多糖（PAP）；取水提取茯苓水溶性多糖后的药渣，依次用0.1mol/L~1.0mol/L梯度NaOH溶液分级提取分离10种茯苓酸性多糖组分（PSAP1-PSAP10）。通过对多糖还原能力、DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率等指标的测定，比较PWP、PAP和10种PSAP1→PSAP10组分的抗氧化活性。研究结果表明，PWP和PAP具有抗氧化作用；PSAP1→PSAP10分级提取的10种多糖组分均具有不同程度的抗氧化作用，其中PSAP8和PSAP9抗氧化作用优于其他组分。综合分析，茯苓多糖具有良好的抗氧化作用，其酸性多糖的抗氧化作用与其酸性强弱相关。

茯苓多糖；酸性多糖；分级提取；抗氧化

茯苓为多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）的干燥菌核，是常用药食两用传统中药大品种。茯苓收载于历年版《中国药典》，具有渗湿利尿、和胃健脾、灵心安神之功效，广泛用于临床治疗和养身保健。据第三次全国中药资源普查统计，在数以万计的中药复方中的配伍率达70%以上，以其为原料或配方的中成药制剂300余种；以茯苓为原料制作的保健食品数十种，备受人们欢迎，茯苓饼、茯苓酒、茯苓糕、茯苓糖、茯苓茶、茯苓面等产品在市场上随处可见。现代药理研究表明，茯苓具有抗肿瘤、调节免疫功能、保肝健脾、镇静安神、利水消肿、抗炎抑菌、抗突变、抗衰老、抗过敏等多方面的药理作用，其有效成分为茯苓多糖和三萜类成分。茯苓多糖为该药材的主要成分，其中酸性多糖含量达84.2%以上。中药多糖类物质抗氧化作用研究报道较多[1-2]，成为当今热点研究课题。羧甲基茯苓多糖抗氧化作用已见文献报道[2]，但茯苓酸性多糖直接抗氧氧化作用尚未见文献报道。本论文采用溶剂法，提取分离茯苓水溶性多糖（PWP）、茯苓酸性多糖（PAP）和0.1mol/L~1.0mol/L梯度NaOH溶液分级分离的10种茯苓酸性多糖组分（PSAP1→PSAP10）。通过多糖还原能力、DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率等测定指标，对上述提取分离的各种茯苓多糖样品进行了抗氧化作用的比较研究，以期为茯苓多糖的开发利用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茯苓饮片：购自于湖北罗田“九资河茯苓规范化种植基地”；二苯代苦味肼基自由基（DPPH）：Sigma公司；双氧水30%（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；二甲基亚砜（DMSO）：上海实验试剂有限公司；FeCl3、FeSO4、水杨酸、三氯乙酸、铁氰化钾、无水乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器

10万分之一天平（BP211D）：SARTORIUS；离心机TGL-16G：上海安亭科学仪器厂；电热恒温水浴锅：上海东星建材实验设备有限公司；UV-2401PC：SHIMADZU。

1.3 方法

1.3.1 茯苓多糖的提取

取茯苓块100 g，加8倍量水加热回流提取3次，每次1 h，合并滤液，浓缩干燥得茯苓水溶性多糖（PWP）；药渣烘干后用70倍量1mol/L的NaOH溶液室温搅拌提取2 h，500目滤布过滤，滤液用20%的HCl中和，得茯苓总酸性多糖（PAP）沉淀；取适量经水提取后的茯苓药渣，通过0.1 mol/L~1.0mol/L梯度NaOH溶液依次分级提取10种茯苓酸性多糖组分，即PSAP1、PSAP2、PSAP3、PSAP4、PSAP5、PSAP6、PSAP7、PSAP8、PSAP9、PSAP10等10个酸性多糖组分，经除盐后干燥备用。

1.3.2 茯苓多糖的还原能力测定[1]

精密称取茯苓多糖各供试品样品，用DMSO溶解，配制成浓度为2mg/mL的供试品溶液。精密量取供试品溶液1mL，加入2.5mL的磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2.5mL1%铁氰化钾溶液混匀，50℃恒温20min，再加入2.5mL10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min离心10min，取上清液2.5mL，加入蒸馏水2.5mL和0.5mL 0.1%氯化铁溶液，在700 nm波长处测定吸光度，吸光度越大，还原能力越强。

1.3.3 茯苓多糖对DPPH自由基清除率的测定[1]

精密称取茯苓多糖各供试品样品，用DMSO溶解，配制成浓度为2mg/mL的供试品溶液。精密量取供试品溶液2mL，加入2mL质量浓度为0.025mg/mL的DPPH乙醇溶液，混匀，静置30min，3 000 r/min离心10min，取上清液，于517 nm波长处测定吸光度，按下列公式计算清除率。

式中：SE为清除率；Ai为2mLDPPH溶液+2mL样品溶液吸光度；Aj为2mL无水乙醇+2mL样品溶液吸光度；A0为2mLDPPH溶液+2mL双蒸水吸光度。

1.3.4 茯苓酸性多糖对羟基自由基清除率的测定[3]

精密称取茯苓多糖各供试品样品，用DMSO溶解，配制成浓度为2mg/mL的供试品溶液。精密量取供试品溶液1mL，加入1mL 6mmol/LFeSO4溶液，混匀后加入1mL 6mmol/LH2O2溶液，混匀后静置10min，加入1mL 6mmol/L水杨酸溶液，空白对照为DMSO，混匀后38℃水浴30min，3 000 r/min离心10min，取上清液于510 nm波长处测定其吸光度，按下列公式计算清除率。

式中：SE为清除率；Ai为样品溶液的吸光度；Aj为双蒸水替代水杨酸时样品溶液的吸光度；A0为空白对照吸光度。

2 结果与分析

2.1 茯苓多糖的还原能力

抗氧化活性成分通过其还原作用清除自由基，还原能力越强，抗氧化活性越强。采用1.3.2所述方法分别测定茯苓多糖各供试样品（PWP、PAP、PSAP1→PSAP10）的还原能力，并进行比较，结果如图1所示。

图1 茯苓多糖还原能力Fig.1 Deoxidization ability of polysaccharide from Poria cocos

由图1可见，茯苓多糖的各供试样品均具有一定还原能力，其中茯苓水溶性多糖的还原能力高于茯苓总酸性多糖，但分级提取的酸性多糖组分PSAP7、PSAP9、PSAP10的还原能力高于PWP。

2.2 茯苓多糖对DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率的测定是筛选和评价抗氧化活性物质的有效方法。采用1.3.3所述方法分别测定茯苓多糖各供试样品（PWP、PAP、PSAP1→PSAP10）对DPPH自由基的清除能力，并进行比较，结果如图2所示。

图2 茯苓多糖对DPPH自由基清除率Fig.2 The scavenging activity on DPPH free ridical of polysaccharide from Poria cocos

由图2可见，茯苓多糖各供试样品均对DPPH自由基有一定清除作用，其中茯苓水溶性多糖对DPPH的清除率高于茯苓总酸性多糖，但分级提取的酸性多糖组分PSAP1、PSAP8、PSAP9对DPPH的清除率高于PWP。

2.3 茯苓多糖对羟基自由基清除率

羟基自由基可与任何大分子物质反应，导致机体受损和基因突变，引起机体衰老和其他病症。采用1.3.4所述方法分别测定茯苓多糖各供试样品（PWP、PAP、PSAP1→PSAP10）对羟基自由基的清除作用，并进行比较，结果如图3所示。

图3 茯苓多糖羟基自由基清除率Fig.3 Thescavenging activity on hyd roxyl radical ridical of polysaccharide from Poria cocos

由图3可见，茯苓多糖各供试样品均对羟自由基具有清除作用，其中茯苓水溶性多糖对羟自由基的清除率高于茯苓总酸性多糖，但分级提取的酸性多糖组分PSAP8、PSAP9对羟自由基的清除率均高于PWP。

3 结论与展望

本论文研究表明，茯苓多糖具有显著性抗氧化活性。由于抗氧化作用与人类健康密切相关，茯苓作为药食两用传统中药大品种，应用历史悠久，在防治疾病和养生保健方面享有盛誉。宋代文学家苏东坡描述茯苓饼的制作与功效：“以酒蒸胡麻，用去皮茯苓少入白蜜为饼食之，日久气力不衰，百病自去，此乃长生要诀”；相传成吉思汗在中原作战患风湿病，服食茯苓治愈；慈禧太后常食茯苓饼，享年74岁（1834-1908）[4]。因此，本论文诠释了茯苓多糖为茯苓药材抗氧化的药效物质基础，从而为该药食两用中药的临床疗效和保健强身功能提供了科学依据。

茯苓多糖主要是酸性多糖，其含量为茯苓总多糖90%以上。本论文采用0.1mol/L~1.0mol/L梯度NaOH溶液分级提取茯苓酸性多糖，得到10种酸性多糖组分，并对其进行了抗氧化作用比较研究。研究结果表明，10种茯苓酸性多糖组分均具有不同程度的抗氧化作用，但各组分酸性多糖抗氧化作用差异明显，其中PSAP8和PSAP9两种酸性多糖组分抗氧化作用优于其他组分。综合分析，茯苓酸性多糖抗氧化作用与其酸性强弱具有相关性。

迄今为止，有关茯苓多糖的研究报道，主要是茯苓多糖通过降解和羧甲基化的研究与开发，直接应用茯苓多糖进行药效学及其保健功能研究鲜见报道。本实验室前期对茯苓水溶性多糖和酸性多糖进行了调节免疫功能、抗肿瘤及阿霉素致肾病大鼠模型的药效学进行了研究，药理效果明显。本论文采用溶剂法和不同浓度NaOH溶液梯度分级提取方法，将茯苓多糖提取分离为水溶性多糖和酸性多糖及10种分级分离的酸性多糖组分；抗氧化试验研究表明，水溶性多糖和酸性多糖均具有明显抗氧化作用，不同浓度NaOH溶液分级提取酸性多糖组分的抗氧化活性与其酸性强弱有关。茯苓多糖不经过降解和羧甲基化反应，直接开发利用可简化工艺，减低成本。因此，本论文研究结果进一步为直接开发利用茯苓多糖提供了实验依据。

本论文后续研究拟对茯苓酸性多糖的分子量、单糖组成和连接方式进行深入研究，探讨其构效关系，并进行抗氧化作用机理研究，以期为茯苓多糖的开发应用提供更充分的参考。

[1]祝子坪,李娜.桑黄菌多糖体外抗氧化作用[J].食品科学,2011,32 (19):92-95

[2]曹宇,高文远,张黎明,等.羧甲基茯苓多糖的抗氧化研究[J].食品研究与开发,2009,30(11):148-151

[3]王曦,罗霞,许晓燕,等.不同乳酸菌菌株抗氧化能力的比较研究[J].食品科学,2010,31(9):197-201

[4]於小波,昝俊峰,王金波,等.我国茯苓药材主要产区资源调查[J].时珍国医国药,2011,22(3):714-716

Study on Antrioxidant Properies of Polysaccharides from Poria cocos

LUHua-jie，LUYan，LIUYan-wen*

（Pharmacy College，Hubei University of Chinese Medicine，Provincial Key Laboratory of Resource and Chemistry of Chinese Medicine，Wuhan 430061，Hubei，China）

In order to provide the theoretical evidences for developing polysaccharides from Poria cocas，antioxidant properties of water-solubillity polysaccharides，acidic polysaccharides and polysaccharides in differentacidicity were compared in this paper.The Poria cocoswater-solubillity polysaccharides（PWP）and Poria cocosacidic polysaccharides（PAP）wereextracted respectivelybywaterand 1mol/LNaOH solution.10 of Poria cocosseparaateacidic polysaccharides（PSAP）componentswereextracted and seperated from the drey of the decoction of PWP by a gradient elution program with 0.1 mol/L-1.0 mol/L NaOH soulutions.The reducing power，DPPH scaveage rate and·OH scaveage rate were used to compare the antioxidant of PWP，PAP and 10 PSAPs.The resultdemonstrated thatboth PWP，PAPhad antioxidanteffectand 10PSAPshad antioxidation in differentdegreas，and PSAP8 and PSAP9were better than others.With comprehensive analysis，polycharrides in poriahavegood antioxidationand theantioxidationofpap is relevantto itsaciditystrength.

Poria cocospolysaccharides；acidic polysaccharides；gradientextraction；antioxidant

2014-04-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.001

“十二五”国家科技支撑计划的子课题（2010BAE00386）

卢华杰（1986—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：中药及其制剂的物质基础研究。

*通信作者：刘焱文（1945—），男（汉），教授，博士生导师，研究方向：中药及其制剂的物质基础研究。