阿托伐他汀对肾间质纤维化大鼠肾脏Toll样受体4表达的影响

朴明姬

阿托伐他汀对肾间质纤维化大鼠肾脏Toll样受体4表达的影响

朴明姬

目的观察阿托伐他汀对肾间质纤维化大鼠模型的肾组织Toll样受体4(TLR4)表达的影响。方法40只10周龄 SD 大鼠随机分为4 组:假手术组、单侧输尿管梗阻(UUO)组和治疗组(分为小剂量阿托伐他汀组和大剂量阿托伐他汀组)。左侧输尿管结扎法制作肾间质纤维化大鼠动物模型。Masson染色观察和评价肾组织炎症、纤维化程度。免疫组化SP法检测梗阻侧肾组织TLR4表达部位和强度, ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。结果假手术组左肾组织炎症浸润不明显, UUO组有大量炎性细胞浸润, 并出现明显的间质纤维化；小剂量阿托伐他汀组和大剂量阿托伐他汀组较UUO组肾间质纤维化明显减轻, 但两组间无显著性差异；与UUO组比较, 两治疗组的肾功、肾组织TLR4和TNF-α含量显著下降 , 但小剂量和大剂量治疗组间无显著性差异。各组间血脂无显著性差异。结论肾组织TLR4和TNF-α在肾间质纤维化发病过程中起着重要的作用, 阿托伐他汀可以通过非降脂相关的机制延缓肾间质纤维化。

肾间质纤维化；阿托伐他汀；Toll样蛋白4；TNF-α

肾间质纤维化是各种炎症和非炎症性肾脏疾病进展的最终结局, 是所有慢性进行性肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同形态学特点, 是导致终末期肾衰竭的重要原因之二［1］。目前认为肾间质纤维化受多方面因素的影响, 近年免疫、炎症学说倍受关注。Toll样受体(Toll-1ike receptors, TLRs)被认为是目前哺乳动物唯一将细胞外抗原识别信息向细胞内传递并引发炎症反应的关键跨膜蛋白［2］, 是参与免疫炎症反应的一个关键因素, 现认为TLR是介导免疫和炎症反应的主体。本实验以单侧输尿管梗阻模型为研究对象, 研究阿托伐他汀在大鼠肾间质纤维化中对TLR4和TNF-α的影响, 以探讨阿托伐他汀对肾间质纤维化的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 SD雌性大鼠40只, 体重200～220 g(大连医科大学实验动物中心提供)。实验前于本院动物实验中心饲养两周, 饲养环境为清洁级。制模型前禁食水12 h。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立与标本采集 雌性大鼠40只 随机分为4组: 假手术组、UUO组、小剂量阿托伐他汀组(20 mg/(kg·d)、大剂量阿托伐他汀组(50 mg/(kg·d), 阿托伐他汀(立普妥,由辉瑞制药有限公司提供)。10%水合氯醛0.4 ml·(100 g)-1腹腔注射麻醉, 打开腹腔沿左肾下极寻找到左输尿管, 用4.0丝线上下结扎两处, 然后从中剪断输尿管以防逆行性感染。假手术组大鼠打开腹腔后分离左侧输尿管但不结扎, 随即关闭腹腔。各药物治疗组均于术前1 d开始用相应药物等量灌胃, 共计给药14 d。假手术组和UUO组以等量蒸馏水灌胃14 d。第14天各组大鼠腹主动脉取血制备血清, 测定血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)和血脂, 取左侧肾组织, - 80℃冰箱保存,取左侧肾组织用10%中性甲醛溶液固定, 常规方法制备切片行病理检查。

1.2.2病理学观察 左侧肾组织行HE及Masson染色, 光镜观察肾间质纤维化情况。取Masson染色切片, 每张切片观察肾皮质中8个不含肾小球高倍镜视野(×400), 以MAP IS-500多媒体病理彩色分析系统计算每例切片肾间质绿染面积占整个视野百分比, 对肾间质纤维化定量分析。

1.2.3ELISA双抗体夹心法测定左肾组织TNF-α 取左肾组织用PBS液冲洗、稀释、制成匀浆, 离心取上清液测定TNF-α含量(试剂盒购自美国RD公司)。

1.2.4免疫组化SP法检测TLR4 的定位和表达 石蜡切片4 μm厚, 脱蜡后3%过氧化氢液封闭过氧化物酶, 行微波抗原修复, 血清封闭, 再逐步加TLR4抗体, 生物素标记的羊抗鼠IgG及辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素(试剂盒购自Abcam公司), 最后经DAB溶液显色。阴性对照除了用PBS代替抗TLR4抗体外, 所有步骤同上, 以细胞浆有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。每张玻片随机选择20个视野(×200),利用图像分析系统(HIPAS-2000)进行吸光度测量并自动转换为A值, 每个标本的TLR4表达强度用20个视野的平均A值表示。

1.2.5统计学方法 采用SPSS12.0统计软件, 实验数据以( x-±s)表示, 组间两两比较采用q检验, 各组间比较采用单因素方差分析, 以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1测定血BUN、Scr、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平变化 与假手术组比较, UUO组血BUN、Scr显著性升高(P＜0.05)；与UUO组比较, 小剂量组和大剂量组显著性下降(P＜0.05)；小剂量组和大剂量组间差异无统计学意义(P＞0.05)。各组间TC、TG、LDL差异无统计学意义(P＞0.05), 见表1。

2.2肾脏病理改变 HE染色中UUO组左侧肾组织可见肾间质水肿、纤维化, 远端肾小管与近曲小管均扩张, 部分萎缩坏死, 见大量纤维细胞增生和淋巴单核细胞浸润出现肾间质纤维化, 但肾小球无明显改变。低剂量阿托伐他汀组和大剂量阿托伐他汀组有轻度肾小管上皮萎缩, 肾小管扩张, 间质中有单核细胞浸润, 肾间质纤维化程度明显轻于UUO组。Masson染色显示, 与假手术组比较, UUO组胶原面积百分比显著性增多；与UUO组比较, 小剂量组和大剂量组胶原面积百分比显著性下降(P＜0.05)；但两治疗组间差异无统计学意义(P＞0.05), 见表2。

表14组大鼠 BUN、Scr、TC、TG、LDL测定结果

表14组大鼠 BUN、Scr、TC、TG、LDL测定结果

注：与假手术组比较,aP＜0.05；与UUO组比较,bP＜0.05

组别BUN(mmol/ L)Scr(μmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL(mmol/L)假手术组4.27±0.8147.53±6.121.44±0.260.69±0.20.46±0.03 UUO组10.67±2.32a103.4±12.19a1.39±0.340.71±0.090.53±0.06小剂量组6.84±2.05b83.59±7.46b1.24±0.280.68±0.040.49±0.07大剂量组7.01±2.08b79.98±11.42b1.29±0.190.62±0.070.41±0.05

表24组大鼠肾组织胶原沉积、TLR4表达水平和TNF-α含量的比较

表24组大鼠肾组织胶原沉积、TLR4表达水平和TNF-α含量的比较

注: 与假手术组比较,aP＜0.05; 与UUO 组比较,bP＜0.05

组别胶原面积百分比(%)TLR4TNF-α(μg/L )假手术组0.8 ±0.054.28 ±0.9534.35 ±9.15 U U O 组25.67 ±3.83a11.57 ±0.05a98.54 ±13.74a小剂量组19.37 ±4.32b8.54 ±1.59b69.58 ±10.04b大剂量组20.12 ±4.28b9.08 ±2.75b71.43 ±11.47b

2.3各组大鼠肾组织TLR4表达和TNF-α含量结果(见表2)TLR4在假手术组大鼠肾脏组织中主要分布在肾近曲小管、远曲小管、集合管、肾间质区、肾血管等部位, 在肾小球系膜区也有一定的表达。UUO组大鼠TLR4在上述区域的表达显著升高, 尤其以肾小管及肾间质区增加最为明显。与假手术组比较, UUO组TLR4、TNF-α显著性升高(P＜0.05)；与UUO组比较, 小剂量组和大剂量组显著性下降(P＜0.05)；小剂量组和大剂量组间差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

Toll样受体最早发现于果蝇胚胎中, 是识别病原微生物的跨膜受体家族, 在免疫应答的诱导和炎症反应中发挥重要作用［3］。Toll样受体的生物学功能有：①调理病原微生物的吞噬作用；②参与抗原提呈细胞(APC)对病原体的识别过程；③激发多种免疫应答基因的转录, 如某些炎症性细胞因子、共刺激分子等；④促发胞内的杀菌机制。TLR4是TLR家族的重要成员, 定位于人染色体9q32-q33上, 它的天然配体是脂多糖(LPS)、脂质磷壁酸(LTA)、HSP(热休克蛋白)60、HSP(热休克蛋白)70等［4］。内源性配体能够激活TLR4, 活化的TLR4及相关配体诱导核因子KB激活, 启动白介素-1、白介素-6、白介素-8、白介素-12、TNF-α及CD80与CD86等基因的转录, 介导各种病原体的识别和免疫活化过程, 从而导致肾脏损伤［5,6］。Tsuboi N等在培养的肾小管上皮细胞研究中发现有TLR4 的表达, 受到LPS 刺激后,细胞TLR4表达增多, NF-κB活性增强, 最后产生相关细胞因子, 启动免疫应答［7］。TNF-α是单核巨噬细胞产生的一种重要的细胞因子, 参与炎症病变的多方面病理生理学变化,如何阻断TNF-α是控制慢性炎症的关键。本实验结果表明, UUO大鼠肾组织TLR4和TNF-α明显升高, 这与文献结果一致。

阿托伐他汀是属于HMG-coA(丙戊二酸辅酶A)抑制剂,是临床上常见的降脂药物。近年发现这类药物除了降脂作用,还存在非降脂相关的肾保护作用。这主要表现为以下几方面：①抗细胞增殖［8］：能抑制肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞、肾间质成纤维细胞, 血管平滑肌细胞等增殖；促进细胞凋亡,抑制细胞外基质的合成和分泌, 促进基质蛋白的降解［9］。②抗炎症作用：抑制单核巨噬细胞在肾血管周围和肾间质的浸润, 抑制4型胶原的表达, 在细胞水平, 可以抑制炎症细胞和肾脏固有细胞合成和分泌各种炎症因子［10］。③调节免疫应答：作用于各种炎症细胞的聚集、分化、增殖和分泌活动。本实验发现, 小剂量和大剂量阿托伐他汀组的肾组织TLR4蛋白和TNF-α较UUO组显著降低, 提示阿托伐他汀可能通过下调TLR4蛋白和TNF-α, 从而减轻炎症反应, 延缓肾间质纤维化的发展。本研究还发现采用阿托伐他汀两种剂量并未显著影响大鼠血脂水平, 小剂量和大剂量组间TLR4蛋白和TNF-α无显著性差异, 提示阿托伐他汀可以通过非降脂相关的机制延缓肾间质纤维化, UUO模型中阿托伐他汀改善肾间质纤维化的作用并无明显的剂量依赖性。

综上所述, 阿托伐他汀可以通过非降血脂机制延缓肾间质纤维化的进展, 这与下调TLR4和TNF-α途径有着重要的联系。这对早期防治肾间质纤维化有重要的临床意义。

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116001 大连大学附属中山医院肾内科