地尔硫卓对心脏缺血再灌注后心肌炎症的影响研究

王智明

·实验研究·

地尔硫卓对心脏缺血再灌注后心肌炎症的影响研究

王智明

目的探讨地尔硫卓对心脏缺血再灌注后心肌炎症的影响。方法首先建立大鼠心脏缺血再灌注模型, 将存活大鼠随机分为缺血再灌注组(I/R组)和地尔硫卓组(D组), 另设假手术组(S组)作为对照。分别在术后1周、2周、4周三个时间点, 对各组大鼠进行超声心动图检测、心肌炎症细胞检测以及多种细胞炎症因子检测。结果术后第4周超声心动图检测, I/R组与S组和D组比较, 左心室射血分数(EF)和左心室短轴缩短率(FS)均有明显下降, 但左心室重量(LVM)却明显增加, P＜0.05, 差异有统计学意义, 心脏功能受到严重影响；I/R组炎症细胞浸润情况明显严重于S组和D组；I/R组致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α在缺血再灌注之后有明显高表达, 抗炎因子IL-10和TGF-β1表达水平较低。结论心脏出现缺血再灌注之后, 地尔硫卓可以有效抑制炎症细胞的活化和炎症因子的分泌, 能够有效减轻心肌细胞炎症反应, 较好的改善心脏功能, 为地尔硫卓临床治疗心脏缺血再灌注后心肌炎症提供了理论基础。

地尔硫卓；心脏缺血再灌注；心肌炎症

心脏缺血再灌注是冠状动脉再通后的主要并发症, 极易引发患者心肌损伤, 甚至造成死亡。研究表明, 心脏缺血再灌注导致的心肌炎症与心肌细胞内钙离子浓度有密切关系,而地尔硫卓(Diltiazem)作为钙离子通道阻滞剂, 能够起到保护心肌细胞、避免心肌炎症的作用, 主要机制可能与其抑制心肌细胞内钙离子浓度有关［1］。本文通过研究大鼠心脏缺血再灌注模型中淋巴细胞表达的各种炎症因子含量以及使用地尔硫卓干预之后各种炎症因子含量发生的变化以及心肌炎症反应的变化, 来探讨地尔硫卓对心脏缺血再灌注后心肌炎症的影响, 现报告如下。

1 材料与方法

1.1大鼠心脏缺血再灌注模型的建立与实验分组 选择实验大鼠：雄性, 体重200～250 g, 均符合Sprague-Dawley清洁级。模型建立前记录大鼠的体重, 然后用戊巴比妥钠进行注射麻醉, 使用小动物呼吸机通过气管插管辅助呼吸, 操作过程中时刻监视心电图的变化。在左侧胸腔处实行开胸, 并打开心包, 在左心右下缘1 mm附近, 使用无损伤缝针穿过左冠状动脉的心肌表层, 进行结扎, 30 min后恢复血流, 最后逐层缝合胸腔。大鼠恢复自主呼吸后去掉呼吸机, 保温待其清醒。假手术组同样经历以上手术过程, 但不进行结扎。选择术后存活大鼠进行后续实验, 所有大鼠均在相同条件下饲养。

大鼠分组：①D组：术后用地尔硫卓干预组30只, 选择1周、2周、4周三个时间点分别注射和口服地尔硫卓,每个时间点10只；②I/R组：心脏缺血再灌注组30只, 在相同时间点注射和口服生理盐水作为对照；③S组：假手术组30只, 同样时间注射和口服生理盐水。

1.2地尔硫卓药物用量 参照中国《不稳定心绞痛治疗建议》中推荐的成人用量30～60 mg t.i.d./q.i.d., 同时参考国外试验用量360 mg/d［2］。本实验制定的D组大鼠用药量为：每天36 mg/200 g, 进行冠状动脉结扎手术后对大鼠进行尾静脉注射地尔硫卓4.5 mg/4.5 ml, 输液泵维持3 h, 后该改为灌胃36 mg/4 ml·200g(36 mg地尔硫卓+4 ml生理盐水), 给药1次/d直到实验结束。

1.3超声心动图检测 在每个时间点处, 1周、2周、4周三个时间点, 进行超声心动图检测。先用适量戊巴比妥钠对大鼠进行注射麻醉, 用二维图像引导做出M型曲线, 并测量。每个时间点选取5个心动周期, 分别记录各项指标值并计算平均值作为该指标的实验数据进行记录, 同时进行图像录像。

超声检测指标包括：心率(HR)；左心室舒张末期内径(LVDd)和收缩末期内径(LVDs)；左心室舒张末期前壁厚度(AWT)和后壁厚度(PWT)；左心室舒张末期容积(LVEDV)和收缩末期容积(LVESV), 计算公式：V=1.04×D3, 其中D为内径；左心室重量(LVM)=［1.05×(LVDd+AWT+PWT)］3-LVDd3；左心室短轴缩短率(%FS)= (LVDd-LVDs)/LVDd×100%；每心搏量(SV)= LVEDV-LVESV；左心室射血分数(%EF)=SV/ LVEDV×100%。

1.4心肌炎症细胞检测 在每个时间点, 提取各组大鼠心肌组织制作石蜡切片, 并用HE染色, 统计各种炎症细胞的数量并记录。

1.5大鼠心肌细胞炎症因子检测 在每个时间点, 提取各组大鼠心肌细胞内各种细胞炎症因子RNA, 然后逆转录并进行PCR反应, 检测各种细胞因此的含量。细胞炎症因子主要包括致炎因子：IL-1β(Interleukin 1β, 白介素-1β)、IL-6(白介素-6)、TNF-α(Tumor necrosis factorα, 肿瘤坏死因子-α),以及抗炎因子：IL-10(白介素-10)、TGF-β1(Transforming growth factor-β1, 转化生长因子-β1)。

1.6统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差表示, 采用χ2检验, 当P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠超声心动图变化情况 术后1周和2周, 各组大鼠超声心动图检测并没有显著性差异；术后第4周超声心动图检测, I/R组与S组和D组比较, 左心室射血分数(EF)和左心室短轴缩短率(FS)均有明显下降, P＜0.05, 差异有统计学意义；左心室重量(LVM)I/R组也明显高于S组和D组, P＜0.05,差异有统计学意义, 证明I/R组心室增厚严重。详见表1。

表1各组大鼠超声心动图变化情况

表1各组大鼠超声心动图变化情况

注：P值为I/R组分别与S组和D组相比较的差异系数

组别HR(bpm)LVM(g)LVEDV(ml)LVESE(ml)SV(ml)EF(%)FS(%) S 462±340.68±0.120.19±0.030.03±0.020.15±0.0388.3±2.956.7±3.7 I/R401±290.92±0.110.20±0.040.06±0.030.14±0.0259.6±3.126.7±2.1 D 359±310.81±0.120.18±0.050.05±0.020.13±0.0273.7±2.937.4±2.6 P值＜0.05＜0.05＜0.05

2.2各组大鼠术后第4周时心肌炎症细胞变化情况 术后第4周时, 光镜下观察各组大鼠心肌组织切片并统计各种心肌炎症细胞的数目。S组心肌炎症细胞很少；I/R组炎症明显, 中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润明显；D组经过地尔硫卓治疗, 心肌炎症细胞明显减少；统计分析I/R组与S组和D组相比较炎症细胞明显较多, P＜0.05, 差异有统计学意义。详见表2。

表2各组大鼠术后第4周时心肌炎症细胞变化情况n=10)

表2各组大鼠术后第4周时心肌炎症细胞变化情况n=10)

注：P值为I/R组分别与S组和D组相比较的差异系数

组别中性粒细胞巨噬细胞淋巴细胞S 10±68±55±2 I/R108±14103±1146±5 D 51±1248±1321±4 P值P＜0.05P＜0.05P＜0.05

2.3各组大鼠术后心肌细胞炎症因子表达情况 结果显示致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α在缺血再灌注之后有明显的提高, 术后1～2周达到峰值, 在第4周稍微降低, 但含量仍较高, 使用地尔硫卓进行治疗之后, 致炎因子表达明显降低, P＜0.05, 差异有统计学意义。I/R组与D组抗炎因子IL-10和TGF-β1表达水平相近, 都没有高水平表达, 因此I/R组表现出的炎症反应明显强于D组。详见表3。

表3各组大鼠术后心肌细胞炎症因子变化情况n=10)

表3各组大鼠术后心肌细胞炎症因子变化情况n=10)

组别第1周第2周第4周IL-1βS0.211±0.0060.124±0.0040.113±0.017 I/R1.658±0.0211.621±0.0251.562±0.034 D0.564±0.0080.634±0.0150.572±0.024 IL-6S0.213±0.0080.212±0.0070.211±0.005 I/R1.102±0.0130.924±0.0150.756±0.014 D0.534±0.0070.512±0.0040.498±0.006 TNF-αS0.224±0.0020.153±0.0070.132±0.004 I/R1.652±0.0141.317±0.0171.134±0.012 D0.762±0.0130.634±0.0110.542±0.012 IL-10S0.143±0.0070.086±0.0040.032±0.001 I/R0.624±0.0140.586±0.0160.241±0.027 D0.543±0.0120.521±0.0110.086±0.007 TGF-β1S0.204±0.0030.156±0.0140.127±0.004 I/R0.678±0.0160.627±0.0130.586±0.006 D0.624±0.0210.581±0.0240.241±0.007

3 讨论

心脏缺血再灌注引起心肌损伤主要是指心脏在短时间内出现供血中断后再恢复供血, 使心肌出现损伤, 且心肌损伤与胞内钙离子浓度升高有密切关系。心脏缺血再灌注后钙离子浓度升高可引起心肌炎症等心肌损伤的主要机制有以下几个方面：Ca2+浓度升高激活Ca2+依赖性蛋白酶、Ca2+依赖性核酸内切酶以及Ca2+依赖性磷脂酶, 从而对细胞产生毒害作用, 诱导心肌细胞细胞凋亡［3］；心脏缺血再灌注引起内皮细胞Ca2+浓度升高, 直接对内皮细胞造成损伤, 还可以增加内皮细胞中粘附因子的表达, 促进血小板和炎症细胞与内皮细胞的粘附, 诱导心肌出现炎症反应［4］。本实验结果显示, 大鼠心脏缺血再灌注后心肌细胞出现不同程度的死亡, 在第4周时心脏出现严重的功能性障碍, 应用地尔硫卓进行治疗的D组大鼠心脏功能得到了有效改善。

光镜下观察各组大鼠在心脏缺血再灌注之后心肌细胞出现炎症情况发现, 心肌细胞出现明显的中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润。文献报道［5］, 冠状动脉堵塞后, 心肌组织缺血区会有大量白细胞的聚集, 且再灌注后白细胞数目不但没有减少反而有增多的趋势。心肌组织缺血较轻的区域白细胞聚集数目也较少。研究表明, 心脏缺血再灌注时心肌组织内白细胞的聚集机制可能与胞内钙离子浓度升高有关。

本实验中观察各组大鼠心肌细胞炎症因子表达情况, 致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达在心脏缺血再灌注之后有明显的提高, 而抗炎因子IL-10和TGF-β1在缺血再灌注之后一直低水平表达, 因此心肌细胞出现严重的炎症反应。TNF-α能够激活和聚集心肌细胞中白细胞, 增强白细胞的吞噬能力, 促进白细胞与内皮细胞的粘附作用, 从而引起心肌炎症［6］；IL-1β可激活炎症级联反应, 活化中性粒细胞,上调粘附因子的表达, 促进TNF-α介导的炎症反应；IL-6能够诱导T细胞的增殖与分化, 促进中性粒细胞的分化［7］。IL-10和TGF-β1均具有免疫抑制作用, 通过调节免疫细胞因子, 抑制炎症反应［8］。

综上所述, 心脏出现缺血再灌注之后, 地尔硫卓可以有效抑制炎症细胞的活化和炎症因子的分泌, 减轻心肌细胞炎症反应, 改善心脏功能, 为地尔硫卓临床治疗心脏缺血再灌注后心肌炎症提供了理论基础。

［1］ 刘英, 程翔, 廖玉华.钙通道阻滞剂与心血管免疫炎症的关系.中国药理学通报, 2007, 23 (2):141-143.

［2］ 陈纪林.不稳定性心绞痛诊断和治疗建议.中华心血管杂志, 2000, 28(6):409-412.

［3］ Gyorgy P, Zoltan V, Rezso G.Ion channels and lymphocyte activation.Immunology Letters, 2004, 92(1):55-66.

［4］ 刘英, 廖玉华, 程翔, 等.大鼠心肌梗塞后心肌炎症反应和细胞因子表达.中国免疫学杂志, 2004, 20 (12):858-861.

［5］ 程翔, 廖玉华, 李彬, 等.心肌梗死后心功能不全患者辅助性T细胞功能失衡及意义.中华心血管病杂志, 2005, 33 (6):526-528.

［6］ Cheng X, Liao YH, Li B, et al.Effects of early treatment with metoprolol on myocardial inflammatory cytokine expression and heart function in rats with acute myocardial infarction.Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi, 2005, 33(5):448-452

［7］ Nissen S E, Tuzcu E M, Libby P, et al.Effect of antihpertensive agents on cardiovascular events in patients with coronary disease and normal blood pressure, The CAMLOT Study: A randomized controlled trial.JAMA, 2004, 292(18):2217-2226.

［8］ Ferenc B, Timea B, Attila M , et al.Effect of hyperglycemia on the basal cytosolic free calcium level, calcium signal and tyrosinephosphorylation in human T-cells.Immunology Letters, 2002, 82(1):159-164.

523900 东莞市太平人民医院心血管内科