清补通络丸质量标准研究

邱远金，朱国强 ，高 辉 ，杨成新，贾晓光

（1．新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002； 2．新疆维吾尔自治区第六人民医院，新疆 乌鲁木齐 830013）

清补通络丸质量标准研究

邱远金1，朱国强1，高 辉2，杨成新2，贾晓光1

（1．新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002； 2．新疆维吾尔自治区第六人民医院，新疆 乌鲁木齐 830013）

目的 建立清补通络丸的质量控制标准。方法 采用薄层色谱（TLC）法鉴别清补通络丸中的丹参、枳壳、延胡索、赤芍，并采用高效液相色谱（HPLC）法测定该药中丹酚酸B的含量。结果 丹参、枳壳、延胡索、赤芍的薄层色谱斑点清晰，分离较好，对应的空白和辅料均无干扰；HPLC法测定结果显示，丹酚酸B进样量在0．28～2．52 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＝0．999 9），平均回收率为97．74%，RSD为1．21%（n＝6）。结论 该方法重复性好、结果可靠，可为清补通络丸质量控制方法的建立提供参考。

清补通络丸；薄层色谱；高效液相色谱；质量标准

清补通络丸（批准文号为新药制字Z20120001）是由新疆维吾尔自治区第六人民医院感染科中医师经多年经验及临床实践总结，由丹参、枳壳、延胡索、赤芍等15味中药组方的纯中药制剂，主要用于治疗急、慢性布鲁杆菌病。本研究中建立了测定该制剂中丹酚酸B含量的高效液相色谱（HPLC）法，并采用薄层色谱（TLC）法对方中君药丹参，臣药枳壳、延胡索和赤芍进行了定性鉴别研究，旨在为建立清补通络丸的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

SK5200型 HP超声仪（59 Hz，200 W）；Metter EL104型电子分析天平；LC20－10A型高效液相色谱仪（岛津）。硅胶G板（10cm×20 cm，硅胶G为青岛海洋化工厂产品）；蒸馏水、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸、乙醇、石油醚（60～90℃），乙醚、甲醇、甲酸乙酯、香草醛、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）等。芍药苷对照品（批号为110736－200731），延胡索乙素对照品（批号为 110726－200610），丹参对照药材（批号为 120923－200911），延胡索对照药材（批号为120928－200604），由中国药品生物制品检定所提供；丹参酮ⅡA对照品（批号为201011），丹酚酸B对照品（批号为201002），新橙皮苷对照品（批号为201004），柚皮苷对照品（批号为201008），由四川维克奇生物科技有限公司提供。清补通络丸（规格为 0．2 g ／丸，批号为 20100615，20100616，20100617），丹参阴性、延胡索阴性、枳壳阴性和赤芍阴性样品均由新疆维吾尔自治区中药民族药研究所提供。

2 方法与结果

2．1 定性鉴别

枳壳：取本品10 g，研碎，加甲醇80 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣用30 mL水溶解，用乙醚洗涤2次，每次30 mL，弃去乙醚液，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，弃去水液，正丁醇液减压浓缩至干，用2 mL甲醇溶解，加在中性氧化铝柱上（100～120目，5 g，内径10～15 mm），用120 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取柚皮苷和新橙皮苷对照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。再取缺枳壳的阴性样品10 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB]试验[1]，吸取供试品溶液及阴性对照品溶液2～3 μL、对照品溶液10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶6∶2）下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热约5 min，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液色谱中则无此斑点，说明阴性对照无干扰（见图1A）。

丹参：取本品20 g，加硅藻土10 g，研磨均匀，加乙醚80 mL，超声处理20 min，滤过，滤液挥干，加乙酸乙酯0．5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材1 g，加乙醚20 mL，超声20 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取丹参酮ⅡA对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺丹参药材的阴性样品20 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB]试验[1]，吸取供试品溶液及阴性对照品溶液各15 μL、对照药材和对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）－乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱中则无此斑点，说明阴性对照无干扰（见图1B）。

延胡索：取本品10 g，加硅藻土5 g，研磨均匀，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材1 g，加甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚振摇提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺延胡索药材的阴性样品10 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB]试验[1]，吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一以0．1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯－丙酮（9∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中约3 min后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液色谱中则无此斑点，说明阴性对照无干扰（见图1C）。

赤芍：取芍药苷对照品，加甲醇分别制成每1 mL含1．0 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺赤芍药材的阴性样品10 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB]试验[1]，吸取枳壳鉴别项下供试品溶液及阴性对照品溶液、对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷 －乙酸乙酯 －甲醇－甲酸（40∶5∶10∶0．2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热使斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的蓝紫色斑点，阴性对照品溶液色谱中则无互斑点，说明阴性对照无干扰（见图1D）。

图1 薄层色谱图

2．2 丹酚酸B含量测定

2．2．1 色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇－乙腈 －甲酸 －水（30∶10∶1∶59）；检测波长：286nm；流速：1mL／min；柱温：30℃。

2．2．2 溶液制备

称取丹酚酸B对照品0．007 1 g，置50 mL容量瓶中，加75%甲醇溶解，定容至刻度，即得质量浓度为0．140 2 mg／mL的对照品溶液。取清补通络丸适量，研碎，精密称取粉末4 g，加甲醇50 mL，精密称定质量，加热回流提取1 h，冷却，称定质量，用甲醇补足减失的质量，滤过，滤液作为供试品溶液。取除丹参外的处方中其余药标按清补通络丸处方与制法制成阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2．2．3 方法学考察

系统适用性及阴性干扰试验：分别取对照品溶液、供试品溶液、缺丹参的阴性对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果阴性对照品溶液图谱中，在丹酚酸B的出峰位置无干扰峰，表明在本试验条件下丹酚酸B峰与其他组分峰分离完全，理论板数按丹酚酸B计算不低于2 000。色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取对照品溶液 2，4，6，8，10，12，14，16，18 μL，分别注入液相色谱仪，按拟订的色谱条件测定面积。以峰面积为纵坐标、丹酚酸B质量为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝1×106X－35 188，r＝0．999 9（n＝9）。结果表明，丹酚酸B检测质量在0．280 4～2．523 6 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10 μL，连续进样5次，按拟订的色谱条件测定峰面积。结果峰面积的平均积分值为 1 338 083，RSD＝0．74%（n＝5），表明方法精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0，2，4，8，16，24 h时按拟订色谱条件测定丹酚酸B峰面积。结果峰面积平均值为 21 315 66，RSD＝1．39%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

重复性试验：准确称取同批次供试品6份，依法制备供试品溶液并测定丹酚酸 B含量。结果平均含量为2．642 7 mg／g，RSD＝1．97%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取已知含量（2．651 0 mg／g）供试品6 份，分别精密加入对照品溶液 0．5 mL（0．140 2 mg／mL），按供试品溶液制备方法制备溶液，各取10 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订的色谱条件测定丹酚酸B含量，计算回收率。结果见表1。

2．2．4 样品含量测定

取3批供试品，按拟订色谱条件和方法测定丹酚酸B的含量。结果批号为20100515，20100516，20100517的3批供试品中丹酚酸B 含量分别为 2．743 8，2．709 2，2．516 4 mg／g，平均 2．656 5 mg／g。因此，暂订清补通络丸中含丹参以丹酚酸B计不得低于2mg／g。

表1 丹酚酸B加样加收试验结果（n＝6）

3 讨论

本试验中采用多指标鉴别和含量测定手法，有利于控制产品质量，保证临床疗效。在枳壳和赤芍的薄层色谱鉴别中，主要在2010年版《中国药典（一部）》[1]的基础上对供试品溶液制备条件进行了优化。供试品经甲醇提取后蒸干、溶解、过中性氧化铝柱、甲醇洗脱，蒸干收集的洗脱液，溶解得供试品溶液；由图1A和图1D可知，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色斑点，且阴性无干扰。丹参和延胡索定性鉴别主要参照2010年版《中国药典（一部）》[2]方法进行薄层色谱鉴别试验，由图1B和图1C可知，在供试品溶液图谱中，与对照品和对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，而阴性对照品溶液色谱在相应位置上则无此斑点，说明阴性无干扰。

丹参作为方中君药之一，作用至关重要，故将丹酚酸B作为含量测定的指标性成分。参考2010年版《中国药典（一部）》丹参项下丹酚酸B含量测定方法，对3批供试品中丹酚酸B含量进行了测定，根据测定结果，暂订清补通络丸中丹酚酸B含量不得少于2 mg／g。因此，文中所建立的方法测定结果较稳定，分离效果较好，可用于制剂的质量控制。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅥB，70－71，130－131，147 －148，229－230．

作者简介：邱远金（1981－），男，汉族，四川内江人，助理研究员，主要从事天然事物化学研究；朱国强，副研究员，主要从事中药学研究，本文通讯作者，（电话）0991－2615137（电子信箱）zgqzyc＠163．com。

Study on Quality Standard of Qingbutongluo Pill

Qiu Yuanjin1，Zhu GuoQiang1，Gao Hui2，Yang Chengxin2，Jia Xiaoguang1（1．Research Institute of Chinese Medicine and Ethnic Drugs of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Wulumuqi，Xinjiang，China830002；2．Sixth People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Wulumuqi，Xinjiang，China830013）

Objective To establish the quality standard of Qingbutongluo Pill．Methods Traditional Chinese medicines in prescription such as Salvia miltiorrhiza Bge，Citrus aurantiumL．，Corydalis yanhusuo W．T．Wang and Paeonia lactiflora Pall were identified by the TLC method．The content of salvianolic acid B in Qingbutongluo Pill was determined by the HPLC method．Results The spots in the TLC were clear and could be well separated，the corresponding blank and adjuvants had no interference；the HPLC method showed that the linear range of salvianolic acid B was 0．28 ～2．52 μg（r＝0．999 9）；the average recovery rate was 97．74% ，RSD1．21% （n＝6）．Conclusion This method is good in repeatability and reliable in the detection results，and can provide reference for establishing the quality control method of Qingbutongluo Pill．

Qingbutongluo Pill；TLC；HPLC；quality standard

R284．1；R286．0

A

1006－4931（2014）02－0048－03

2012－09－24；修回日期：2013－07－11）