氨基酸柱前衍生化法在动物药质量控制中的应用*

2014-07-14徐德生

中国药业 2014年2期

李婷，刘力，徐德生

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021）

中药在我国已经有着几千年的悠久历史，在应用过程中形成了独特的理论体系和应用形式，见证了我国历史文化的繁荣发展以及自然资源的丰富多彩，对于中华民族的繁衍生息作出了重大贡献[1]。动物药作为中药的重要组成部分之一，在疾病预防、治疗等方面发挥着重要的作用。近几年来，动物药的应用受到越来越广泛的重视，其活性成分研究也获得了较大的进展。蛋白质、多肽、氨基酸等作为动物药的有效成分，其质量控制对于评价动物药质量的优劣非常关键。目前应用于氨基酸检测的方法很多，柱前衍生化法具有操作简单、方便易行、检测快速准确的优点，被广泛应用于动物药中氨基酸类成分的测定。柱前衍生化法属于氨基酸间接分析法之一，是使样品组分在特定的条件下发生化学反应，转变为发色或发光的衍生物后，再进行色谱的分离和测定。它具有衍生化的条件可以任意选择，衍生化反应的溶剂可与流动相不匹配，衍生化过程中产生的副产物可预先除去以免干扰检测等诸多优点。现就目前动物药中氨基酸类成分检测的几种常用柱前衍生化方法研究情况进行介绍。

1 样品制备

1．1 游离氨基酸制备

动物药中含有丰富的蛋白质、氨基酸类成分，其中只有小部分氨基酸以游离态存在于药物中，大多数氨基酸都以结合态存在于蛋白质、肽中，因此许多情况下需要水解后再进行测定。游离氨基酸一般以游离态的形式存在于药材中，较易溶出，选择适宜的溶剂，采用超声法或微波法即可提取出来。

1．2 非游离氨基酸制备

对于结合态的氨基酸，需要使用化学物理方法使蛋白质、肽类降解后进行检测，且水解法能较全面地反映出样品中氨基酸的情况，常用的水解方法有以下几种。

酸水解：是最常用的一种水解方法，其原理是使蛋白质等在强酸条件下水解为小分子的肽类或氨基酸。水解液的组成为含0．1% ～1．0% 苯酚的 6 mol／L HCl溶液[2]，通常是将样品置安瓿瓶中，加入水解液抽真空封口，再置高温环境中水解。常用水解温度和时间有110℃和24 h，130℃和5 h，150℃和1 h，可根据试验需要灵活选择。酸水解法操作简单、应用广泛，但可引起一些或部分氨基酸的破坏，会对分析结果造成影响。

碱水解：适宜浓度的碱液可使胶原蛋白发生降解，释放小分子物质到溶剂中[3]。碱水解法常用溶液为6 mol／L NaOH溶液或4%CaO溶液。碱水解法水解迅速、彻底，对于色氨酸的测定较适用，但会使含羟基和巯基的氨基酸全部被破坏且产生消旋现象。

酶水解：酶具有很高的活性和专一性，其水解反应可在常温常压以及温和的酸碱条件下进行[4]，无环境污染，水解产品营养价值高，对于动物药鲜药材的水解有着很大的优势。酶水解蛋白对氨基酸没有破坏作用，但一种酶只能使其发生部分水解[5]，很大程度上限制了其在蛋白质水解测定中的应用。

微波水解：是指样品和溶剂共同处在微波场中时，组分分子受到高频电磁波的作用产生热效应，从提取物中迅速扩散到溶剂中，快速完成水解过程的一种方法。与传统的水解方式相比，微波水解法具有加热时间短、效率高、简便易行等优点，可极大地提高了样品中蛋白质、肽类成分的水解效率[6]，但需要特别的装置，样品水解时间可根据样品的性质等来确定。

2 衍生化方法的优势

研究表明，大多数氨基酸无紫外吸收，需要通过衍生化，在一定条件下利用某个特定试剂在色谱柱前与样品进行化学反应，使反应产生的衍生物利于色谱的分离或检测[7]。柱前衍生反应条件可以任意选择，无反应动力学的限制；衍生化副产物对样品分析产生的干扰可通过预处理以降低或消除；允许多步反应的进行；衍生化试剂的选择较多；仪器设备要求相对简单，应用广泛。

3 几种常用的衍生化方法

3．1 异硫氰酸苯酯衍生化法

原理：异硫氰酸苯酯（PITC）可在室温下改变氨基酸原有的结构，引入苯环，生成苯氨基硫甲酞衍生物（PTA－AA），衍生物可进行高效液相色谱（HPLC）检测[8]。

优点：可同时与一级、二级氨基酸发生反应；衍生产物较稳定，冻干后可于－20℃冷冻贮存1个月，在水溶液中衍生产物4℃可冷藏贮存72 h，色谱响应值无明显变化；衍生产物单一，副产物少。

缺点：样品制备过程烦琐；残留试剂需采用特定方法预先除去；衍生试剂对色谱柱有较大伤害等。

应用：骆达等[9]采用PITC法分析龟甲中胶原蛋白，定量分析了其中的羟脯氨酸，并计算得到龟甲中胶原蛋白的量，此法适用于龟甲胶原蛋白的快速分析。吴萍等[10]以PITC为衍生试剂分离并测定羚羊角和羚羊角塞针剂中氨基酸含量，结果表明羚羊角及其角塞针剂中都富含脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸等16种氨基酸，从两种针剂中分离出近20个色谱峰，对其中6个较大的峰作质谱（MS）分析，从另一个角度验证了羚羊角及其角塞针剂中含有相似的成分，为羚羊角及其角塞针剂有效成分的测定和开发提供了实验依据。石岩等[11]研究测定了10批鹿角胶样品中丝氨酸、精氨酸、苏氨酸等9种氨基酸，建立了其中L－羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L－脯氨酸4个氨基酸的含量测定方法，为鹿角胶的进一步质量控制奠定了基础。

3．2 2，4－二硝基氟苯衍生化法

原理：2，4－二硝基氟苯（DNFB）在弱碱性（pH 8～9）、暗处、室温或加热条件下，很容易与氨基酸的α－氨基发生反应，衍生产物呈黄色。

优点：可同时与一级、二级氨基酸反应；衍生产物性质稳定；灵敏度高。

缺点：衍生步骤烦琐；试剂毒性较大；对色谱柱伤害较大；衍生化副产物会影响分离效果[12]。

应用：赵清等[13]以DNFB为衍生剂，建立了测定僵蚕不同炮制品中游离氨基酸和牛磺酸含量的柱前衍生HPLC法，表明僵蚕经过炮制后体内游离氨基酸含量有不同程度的降低；不同的炮制方法对僵蚕各指标性成分含量有一定程度的影响，但影响幅度不同。王殿波等[14]采用DNFB法比较了不同生境及地区的哈蟆油药材中氨基酸含量，结果表明同一地区林下产哈蟆油药材中氨基酸含量普遍高于稻田产，相同生境中林下产哈蟆油药材以吉林产地氨基酸含量最高，稻田产哈蟆油药材以辽宁产地氨基酸含量最高，这对于该药材的质量评价具有一定实际意义。詹云丽等[15]采用该法建立了广地龙药材中氨基酸类成分的HPLC指纹图谱分析方法，考察了15批广地龙药材中18种氨基酸的含量，结果表明其HPLC指纹图谱有较大的相似性，但含量有所差异，为广地龙药材的生产、鉴别和质量控制提供了依据。

3．3 6－氨基哇琳基－N－琥珀酰－亚胺基甲酸酯衍生化法

原理：6－氨基哇琳基－N－琥珀酰－亚胺基甲酸酯（AQC）是近年来广泛使用的柱前衍生化试剂之一。AQC是一种具有反应活性的杂环氨基甲酸酯，与氨基酸反应，迅速生成高稳定性的脲[16]。

优点：可与一级、二级氨基酸同时反应；衍生物性质稳定；有很强的紫外吸收。

缺点：衍生试剂的水解产物影响分离。

应用：杨辉等[17]以AQC为衍生剂，采用HPLC法测定了全蚕粉中氨基酸成分，结果所测定的3批全蚕粉蛋白质含量高达60%，含16种氨基酸，含量为20%，其中必需氨基酸约占50%，为家蚕的进一步开发提供了依据。朱伟伟[18]以AQC为衍生剂，建立了犀牛角中氨基酸类成分的柱前衍生化含量测定方法，并对其中17种氨基酸的含量进行比较分析，试验结果表明，犀牛角中含有大量的氨基酸，其总氨基酸含量高达41．3%，这对于犀牛角药用价值的研究以及寻找新的犀牛角药用替代物具有积极意义。

3．4 邻苯二甲醛衍生化法

原理：邻苯二甲醛（OPA）以巯基乙醇作为还原剂时可与一级氨基酸反应，生成异吲哚结构衍生物，具有强荧光。

优点：衍生反应快速彻底，灵敏度高，成本相对较低，且衍生化试剂过量不会影响样品的分离。

缺点：不能与二级氨基酸直接反应；氨基酸衍生物极不稳定，衍生后需立即进样分析；胱氨酸衍生产物产量很低而不能被检出。

应用：李晓蒙等[19]采用OPA柱前衍生反相HPLC法测定了水牛角与羚羊角中氨基酸类成分，发现这两种角类药材中氨基酸的种类基本相同，但含量有较明显差异，天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸和酪氨酸在羚羊角中含量较高，水牛角含量相对较高的氨基酸则是丙氨酸和缬氨酸，说明柱前衍生化法HPLC可用于这两种药材的鉴别研究。赵建国等[20]将僵蚕提取液用盐酸水解后，采用柱前衍生化HPLC法测定了其中15种氨基酸的种类与含量，结果表明僵蚕提取液中蛋白质和多肽为主要组成部分，为僵蚕抗凝活性作用物质基础研究提供了依据。李清霞等[21]以OPA柱前衍生化法对桑蚕蛹中13种氨基酸的组成及含量进行了分析，为开发蚕蛹新资源提供了理论依据。宋建平等[22]采用柱前衍生化HPLC法分析不同年龄不同部位麋鹿角中18种氨基酸的含量，并与鹿角进行比较，结果表明不同年龄不同部位麋鹿角中氨基酸组成相似，亦与鹿角相似，但含量均有所差异，这为麋鹿角的资源开发利用、药材品质评价提供了科学的参考依据。

3．5 OPA－FMOC衍生化法

原理：9－氯甲酸芴甲酯（FMOC－Cl）在特定的条件可与氨基酸类成分反应生成具有强荧光性质的产物（FMOC－AA）。因OPA只能与一级氨基酸反应，故实际应用中常将两种试剂合用，先用OPA与一级氨基酸反应，再用FMOC－Cl与其余氨基酸反应，以对样品中氨基酸进行较全面的检测。

优点：反应迅速、完全；化合物稳定；方法简便、快速；可同时测定一级与二级氨基酸。

缺点：FMOC－CL本身及其水解产物（FMOC－OH）都有荧光，会在一定程度上干扰色谱的分离；与一些氨基酸形成的衍生产物不稳定，如组氨酸。

应用：刘相辉等[23]采用柱前衍生HPLC法进行了水蛭提取物中游离氨基酸和水解总氨基酸的含量测定研究，测定了水蛭提取物中的17种氨基酸，为水蛭的质量评价提供了依据。裴福成等[24]采用邻苯二甲醛（OPA）、FMOC联合柱前衍生HPLC测定地龙中的游离氨基酸及水解氨基酸的含量，结果各氨基酸在26 min内均得到较好分离，适宜于地龙药材中氨基酸的快速测定。

4 几种衍生化方法比较

适宜的衍生化方法是柱前衍生化试验成功的关键步骤，衍生化程度完全与否影响试验结论的正确性。衍生化的内容一般包括衍生化试剂组成、衍生化时间、温度等几种常用衍生化方法的比较见表1。

5 几种衍生化样品检测方法比较

不同的衍生化方法得到的衍生物，因其本身的性质不同，需选择适宜的流动相以及检测器，主要包括检测波长、流动相、柱温、检测器等条件。几种常见的衍生化样品的检测方法见表2。不同的实验室、操作人员、仪器设备可能在同样的检测条件下会得到不同的检测结果，试验时应根据实际情况对上述检测条件进行相应的调整。

表1 几种常见的衍生化方法比较

表2 几种常见的衍生化样品检测方法比较

6 结语

与柱后衍生化方法相比较，柱前衍生化分析的成本低、灵敏度高、分析时间短，适宜于中药材中氨基酸类成分的分析。但衍生化过程中，形成的副产物可能对样品色谱分离造成影响，或有可能产生杂质或引入干扰峰，或步骤烦琐易造成样品损失。由于中药材的成分复杂，在实际应用时，需要根据试验需求选择合适的衍生试剂和衍生方法。

衍生化试剂对反相色谱柱的伤害较大，进行样品检测时，应尽量除去样品中残留的衍生化试剂，或使用预柱加以保护，并及时冲洗色谱柱，以延长色谱柱的使用寿命。

由于全球气候大环境的改变，许多动物都濒临灭绝，在我国已应用多年、疗效显著的贵重动物药资源如犀角、虎骨等也逐渐短缺，市面上以次充好的现象屡见不鲜。而且部分动物药在中药复方制剂中作为君药使用，其质量的优劣很大程度上影响了药物的疗效以及中药材及其复方制剂的国际化步伐。因此，动物药的质量控制非常关键。

动物药中氨基酸类成分的控制虽然可在一定程度上评价药材质量的优劣，在药材的鉴别方面可以起到辅助作用，但并不能代表药材中蛋白质、肽类成分的整体质量。另外，应用于临床疗效显著的动物药，由于药物本身的复杂性，目前存在药物成分不明确、药效物质基础研究较少等问题。因此，需要将多种科学手段联合起来，以多种成分的有效控制共同表征药材的质量，扩大药物的适应证，为中药材走向国际化打好基础。

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