黄连上清丸中金胺O的检测方法研究*

2014-07-14饶伟文

中国药业 2014年2期

吴萌，饶伟文

（广西壮族自治区桂林食品药品检验所，广西桂林 541002）

黄连上清丸为国家基本药物收载于2010年版《中国药典（一部）》，由黄连、黄芩、黄柏和大黄等17味中药组方，具有散风清热、泻火止痛的功效，用于风热上攻、肺胃热盛所致的头晕目眩、暴发火眼、牙齿疼痛、口舌生疮、咽喉肿痛、耳痛耳鸣、大便秘结、小便短赤等[1]。由于市售的黄连、黄芩、黄柏均有染色掺假现象[2－5]，且仅按药典收载的检测项目还无法检测这些掺假情况。黄连上清丸生产企业达100多家，中成药生产环节极有可能有掺假中药材流入。为此，本研究中，在原有研究成果[3－5]的基础上，建立了检查黄连上清丸中可能掺入的金胺O的方法。

1 仪器与试药

Waters 2695型高效液相分离系统－Quattro Micro质谱联用仪，Waters 2998型 PAD检测器。金胺 O（Auramine O，中国医药＜集团＞上海化学试剂公司，批号为F20020818）；乙腈、乙酸铵、冰醋酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。按照处方工艺，自制黄连上清丸样品（金胺O阴性对照品），并另外加入适量金胺O作为阳性对照品；黄连上清丸（市售，批号见表2）。

2 方法与结果

2．1 高效液相色谱－二级管阵列检查法（HPLC－DAD）检测

2．1．1 色谱条件

色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈－含 0．5% 冰醋酸的 0．05 mol／L 乙酸胺溶液（28 ∶72）；检测波长：432 nm。理论板数按金胺O主峰计算不低于2 000。

2．1．2 溶液制备

精密称取金胺O适量，加70%乙醇制成每1 mL中含5 μg的溶液，作为对照品溶液。取供试品，包括金胺O阴性对照品和阳性对照品粉末3 g，加70%乙醇25 mL，密塞，超声处理20 min，滤过，量取续滤液5 mL，滤液通过中性氧化铝柱（100～200目，内径为 1．5 cm，5 g），以 25 mL 95%乙醇洗脱，收集流出液，蒸干，残渣加70%乙醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。

2．1．3 测定法

取供试品溶液10 μL，对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。如果供试品出现与金胺O对照品保留时间相同的色谱峰，则比较二者的UV光谱图。结果阳性样品溶液呈现与对照品溶液保留时间相同的色谱峰，而且该色谱峰在300～500 nm波长范围的吸收光谱相同，而阴性对照品溶液则无相对应的色谱峰，见图1。

2．2 高效液相色谱－质谱法（HPLC－MS）确证

2．2．1 色谱条件

色谱柱：Waters Xterra（R）MS C18柱（150 mm ×2．1 mm，5 μm）；流动相：乙腈－0．01 mol／L 乙酸铵溶液（22∶78），流速：0．3 mL ／min，进样量：10 μL，柱温：35 ℃。

2．2．2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）正离子检测；毛细管电压：3．0 kV；锥孔电压：35 V；脱溶剂气流速 350 L ／h，锥孔气流速：50 L ／h；源温度：110℃；去溶剂气温度：350℃。扫描方式采用全扫描一级质谱、全扫描二级质谱（MS／MS）。m／z范围为 50～300 amu。

图1 HPLC－DAD色谱图与光谱图

2．2．3 检测结果

取上述阳性样品以及金胺O对照品溶液，用HPLC－MS检测。结果二者出现相同的选择离子流色谱峰，且其分子离子峰m／z均为268，碎片离子峰m／z均为147（见图2）。因此，确证检出金胺O。

2．3 高效液相色谱（HPLC）法方法学考察

专属性试验：上述2．1项下的试验已证实本法对金胺O的检测具有专属性，不受黄连上清丸中有关成分的干扰。

仪器检测限与定量限确定：当信噪比为3时，测得仪器检测限为 0．004 μg；当信噪比为 10 时，测得仪器定量限为 0．008 μg。

方法检测限与定量限确定：取金胺O对照品适量，加入阴性样品中，按2．1项下方法提取、净化、测定。当信噪比为3时，测得方法检测限为3．5μg／g；当信噪比为10时，测得方法定量限为7μg／g。

线性关系考察：精密称取金胺O对照品10．21 mg，置100 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取金胺 O 对照品溶液 1 mL，分别置 5，10，20，25，50，100 mL 容量瓶中，加70%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，分别用0．45 μm的微孔滤膜过滤，再取滤液分别进样，按拟订色谱条件测定。以对照品质量浓量为横坐标（X，μg／mL）、峰面积积分值为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程Y＝61 274X－1 814，r＝0．999 9（n＝6）。结果表明，金胺O质量浓度在1～20 μg／mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

图2 HPLC－MS一级质谱和二级质谱图

精密度试验：取同一对照品溶液，在同一色谱条件下重复进样 6次，每次 10 μL。结果金胺 O主峰峰面积RSD＝1．4% （n＝6），表明仪器精密度良好。

加收率试验：取黄连上清丸阴性样品9份，每份3g，精密称定，分别加入适量金胺O对照品，使加入量为方法检测限、2倍方法检测限、10倍方法检测限，按2．1项下方法提取、净化、测定，计算回收率。结果见表1。

2．4 样品含量测定

取市场调查中收集的9批黄连上清丸样品，按上述2．1项和2．2项下方法进行定性和定量测定。结果见表2。

3 讨论

金胺O（C17H22N3Cl）又名碱性嫩黄、碱性荧光黄、金丝雀黄、盐酸氨基四甲基二氨基苯甲烷等，是一种化工染料，属于接触性致癌物，在国外早已列为禁用染料，更不能用于食品着色[6]。该品已被用于黄连、黄芩、黄柏的染色掺假，对于以此为原料生产的中成药，有必要增加金胺O的补充检测方法。从表2的检测结果可见，9批黄连上清丸中有1批检出金胺O，HPLC－DAD法与HPLC－MS的检测结果一致，没有误判现象出现。因此，所建立的可作为本产品质量监控的补充检测方法。

表1 金胺O回收试验结果（n＝9）

在制备供试品溶液时，比较了不同的提取溶剂，即70%乙醇、乙醇、无水乙醇，结果70%乙醇提取率较高；在提取方法的选择上，比较了回流、超声及振摇，结果都较好，但超声提取简便、迅速。对超声处理30，20，15，10 min的测定结果进行比较，表明超声处理30 min和20 min含量基本一致。

将样品通过中性氧化铝柱，目的是为了除去处方中大黄的蒽醌类成分的干扰，提高方法检测限。比较了70%乙醇、乙醇、无水乙醇3种洗脱剂，70%乙醇洗脱力较强，蒽醌类成分也会被洗脱下来；无水乙醇在中性氧化铝柱上的通过率较低，洗脱时间长；故选择乙醇作为洗脱剂。且金胺O其水溶液温度超过70℃时会分解为四甲基苯甲酮，乙醇含水量低，易低温蒸干，便于定量分析。

对于HPLC流动相的选择，比较了多个洗脱系统的流动相，结果发现采用文中流动相分离效果最佳。通过改变流动相比例、流速、柱温，在不同的仪器、色谱柱和不同的人员操作，检测结果基本一致。