代料配方与传统松木栽培茯苓的质量分析比较研究*

2014-07-13周元科孙盼盼刘焱文

天津中医药 2014年8期

杨祺，周元科，黄婕，孙盼盼，刘焱文

（湖北中医药大学药学院，湖北省中药资源与中药化学重点实验室，武汉 430061）

茯苓是多孔菌科真菌Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，其菌种寄生于松木的根茎繁殖而成。茯苓为中国特有药食两用中药，史载于古典医著《神龙本草》，列为上品；收载于历年版《中国药典》一部，具有渗湿利尿、和胃健脾、宁心安神的功效[1]。现代临床研究表明，茯苓及其配方具有抗疲劳、抗脑卒中后抑郁、治疗慢性肾小球肾炎、腹泻等疗效[2-5]。茯苓广泛应用于药品和食品行业，为中药大品种。据第3次全国中药资源普查统计，该药材每年的需求量为1.5万吨以上[6]。由于历年过度采挖，中国野生茯苓药材极为稀少，濒临灭绝，所需药材依赖人工栽培。传统栽培茯苓方法是砍伐松木作为菌种繁殖药材的原料，每年消耗大量的松木，严重影响生态环境。因此，寻找替代松木栽培茯苓的原料是我国科学工作者面临的重要研究课题。笔者对茯苓药材的资源调查、药效物质基础、质量分析、规范化种植等[7-10]进行了多年的研究。在前期研究基础上，近年来笔者开展了代料配方栽培茯苓的研究工作，以期寻求代替松木栽培的原料。本研究采用现代仪器分析方法对代料配方与传统松木栽培茯苓的有效成分含量进行比对分析研究，从而为代料栽培茯苓的应用前景提供了参考依据。

1 仪器与材料

Agilent1100高效液相色谱仪，UV-2401紫外检测器，Agilent色谱工作站（美国Agilent公司），UV-2401紫外可见分光光度计（日本岛津），KQ3200DE型超声波清洗仪 (昆山市超声仪器有限公司)，Sartonus型电子天平（十万分之一，德国）。

代料配方见表1，代料配方与传统松木栽培茯苓药材为本项目组在罗田九资河种植，经本院鉴定教研室吴和珍教授鉴定为定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf，通过发汗，去皮，切块，阴干，粉碎过60目筛。菌种均为同仁堂1号（T1），由湖北省中医药研究院提供。茯苓酸对照品为本实验自制。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总多糖的含量测定参考文献[11]。

2.1.1 苯酚溶液的制备取苯酚50 g，加铝片0.05 g和碳酸氢钠0.025 g，置于圆底烧瓶，常压蒸馏并收集182℃的馏分，冷却后称取馏分5.00g，置于100mL量瓶中，加蒸馏水95 mL稀释至刻度，摇匀，滤过至棕色试剂瓶，摇匀，即得5%苯酚溶液。

2.1.2 多糖的提取纯化方法精密称取茯苓粉末1.0000 g，置于 50 mL 烧瓶中，加 25 mL（60～90）石油醚于80℃水浴回流2h，冷却，过滤，滤渣挥干溶剂置于200mL烧杯中，加0.1mol/LNaOH溶液100mL，冰浴搅拌1 h（＜5℃），混合溶液以3000 r/min的速度离心分离20 min，取上清液，用10%冰乙酸溶液调pH值至5～6，待其成黏糊状，将糊状物离心，弃上清液，再次离心并弃上清液，下层得白色凝胶状沉淀，即为茯苓总多糖。

表1 6种栽培茯苓样品的代料配方Tab.1 Six kinds of substitutes synergy ingredients

2.1.3 供试品溶液制备取上述茯苓多糖，约1 g，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加水混溶解至刻度，缓慢搅拌均匀，再吸取0.25 mL至10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，即为茯苓多糖供试品溶液。

2.1.4 对照品溶液的制备精密称取减压干燥至恒重的无水葡萄糖对照品0.00152 g，置于25 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀得0.0608 g/L的对照品溶液。

2.1.5 样品的测定分别精密称取各代料配方样品茯苓粉末约1.0000 g各3份（平行测定3份），按照上述方法制得供试品溶液，精密量取2.0 mL供试品溶液于20 mL试管中，分别加入5%苯酚溶液1.75 mL，充分混合后，缓慢加入6.0 mL浓硫酸，迅速摇匀，放置40 min，在紫外可见分光光度计上，于490 nm处测定样品的吸光度值（平均值），见表2。

2.2 总三萜的含量测定参考文献[11]。

2.2.1 对照品溶液制备精密称取茯苓酸对照品0.00251 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用，即为浓度0.1004 g/L的对照品溶液。

2.2.2 样品的测定精密称取各代料样品茯苓粉末约0.5000 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入甲醇15 mL，超声提取90 min，过滤，用适量甲醇洗涤药渣，定容至刻度，摇匀。吸取0.4 mL于10 mL的具塞试管中，水浴挥干溶剂，冷却，准确加入0.4 mL 5%香草醛冰醋酸溶液和1.8 mL高氯酸，混匀，盖塞，置70℃恒温水浴加热20 min，取出，冷却至室温，加入冰醋酸5 mL，摇匀，于540 nm处测定吸光度，结果见表3。

表2 代料配方与传统松木栽培茯苓的多糖含量测定Tab.2 The total polysaccharides determination results of Fuling and substitute cultivated Fuling

表3 不同代料茯苓总三萜含量的测定结果Tab.3 The total triterpenoid determination results of Fuling and substitute cultivated Fuling

2.3 茯苓酸的含量测定参考文献[12-15]。

2.3.1 色谱条件色谱柱型号：Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5μm），柱温：30℃，流动相：乙腈－0.2%乙酸（82∶18），流速：1.0mL/min，检测波长：210nm。色谱图见图1。

2.3.2 对照品溶液制备精密称取茯苓酸对照品2.0214 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，密封，即得浓度为0.2022 g/L的茯苓酸对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备精密称取茯苓粉末约0.5000 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，准确加入甲醇15 mL及10 mL，加塞精密称定，超声两次，每次30 min，放置室温后滤过，甲醇洗涤滤渣，合并滤液，定容至25 mL。精密吸取续滤液5 mL于蒸发皿中，水浴挥干，用甲醇溶解残渣至2 mL量瓶中，即得。

图1 测定样品茯苓HPLC图Fig.1 The HPLC figure of Fuling

2.3.4 样品的测定称取各代料样品的茯苓粉末，约0.5 g，精密称定。按照上述方法制备供试品溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液密封备用，分别精密吸取各供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定并计算茯苓酸的含量，结果见表4。

表4 代料配方与传统松木栽培的有效成分茯苓酸的含量测定Tab.4 The Poria acid assay results of Fuling and substitute cultivated Fuling

2.4 茯苓提取物的干膏收率的测定

2.4.1 茯苓醇提物的测定将各代料样品的茯苓饮片加8倍量的70%的乙醇回流提取2次，每次分别为2 h、1 h，过滤，合并滤液，挥干溶剂，干燥恒重，测定醇提物的干膏得率。

2.4.2 茯苓水提物的制备将上述乙醇提取后的药渣用8倍量的水回流提取3次，每次1 h，过滤，合并滤液，蒸干，恒重，测定水提物的收率。

2.4.3 茯苓碱水提取物测定再将上述水提后的药渣采用70倍量的0.5 mol/L NaOH搅拌提取1 h，过滤，滤液用HCL中和，离心，除盐，再离心，干燥恒重，测定碱水提取物的收得率。

上述3种提取物干膏得率其测定结果见表5。

2.5 代料配方与传统松木栽培茯苓质量分析的加权综合评价将代料配方与传统松木栽培茯苓各供试样品测定的总多糖、总三萜、茯苓酸、醇提物、水提物、碱水提取物等指标，采用Excel2007软件处理，加权综合评分，评价结果见表6。

表5 代料配方与传统松木栽培茯苓的3种提取物收得率Tab.5 Three extracts of dry extract of Fuling and substitute cultivated Fuling %

3 讨论

根据诸多文献报道，以及前期研究结果表明，茯苓的主要有效成分为茯苓多糖和茯苓三萜类成分。本研究以茯苓多糖、总三萜、茯苓酸（三萜类成分）、茯苓提取物为考察指标，对代料配方与传统松木栽培茯苓进行质量分析比对研究。研究结果表明，代料配方栽培茯苓的多数测定指标优于传统松木栽培茯苓；加权综合评价统计分析结果表明，代料配方栽培茯苓各组得分均高于传统松木对照组，传统松木栽培茯苓组排次末位。因此本研究证明了代料栽培茯苓的质量优于传统松木栽培茯苓，从而为代料栽培茯苓的应用前景提供科学依据，对于保护松林生态环境具有潜在意义。

加权综合评分结果表明，6种代料配方栽培茯苓的质量存在较大的差异。代料配方C和F实验组得分最高，其排名位次并列第一，其他代料配方实验得分顺序为F>A>D>B。因此本项目统计分析结果为代料配方栽培茯苓的后期研究奠定了良好的基础。拟分析和调整代料配方的物料组成或配伍比例，进一步开展代料栽培茯苓研究，优选最佳代料配方。