虚寒状态大鼠肝脏能量代谢变化研究*

2014-07-13李连珍薛春苗刘小青

天津中医药 2014年8期

李连珍，薛春苗，张冰，刘小青

（1.河南农业大学农学院，郑州 450002；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；3.北京中医药大学中药学院，北京100029）

在药性理论研究的过程中，证候模型的塑造和研究至关重要。虚寒状态动物模型的建立和界定，近年来也进行了大量研究[1-3]。虚寒状态，临床又称为虚寒证或阳虚证，是中医临床常见的一种证型，一般认为是体内阳气虚衰所致，其宏观症状主要有四肢怕冷、身体蜷卧、畏寒、喜温喜暖等。而“寒”的本义与客观的温度相关，陆明等[4-5]也发现虚寒证患者7处温度与正常人相比差异有统计学意义，并认为虚寒证肢冷患者的肢体温度降低是由产能不足与储能不足或生物利用度低下两方面原因造成的，是一种整体的功能失调，故虚寒证患者可能涉及能量代谢障碍。那么虚寒状态动物模型的能量代谢又会如何变化？本研究在课题组前期工作的基础上[6]，选择氢化泼尼松诱导大鼠虚寒状态，观察虚寒状态下大鼠肝脏能量代谢相关因子变化特点，为虚寒证动物模型的深入研究提供参考。

1 材料

1.1 药物与试剂注射用氢化泼尼松琥珀酸钠（天津生物制药有限公司生产，每只50 mg，批号：20100310），琥珀酸脱氢酶（SDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20100720），三磷酸腺苷酶（ATPase）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20100620），偶联蛋白-2（UCP-2，兔一抗（博士德生物工程有限公司），羊抗兔二抗（博士德生物工程有限公司），DAB（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 仪器 2000UV紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司生产），Centrifuge5415D台式离心机（德国Eppendorf产品），德国Hei dolph公司DIAX900型内切式匀浆器，BS323S电子天平（德国赛多利斯股份公司），CX4型全自动生化分析仪（美国贝克曼公司），XSP-2C生物显微镜（日本尼康公司）。

1.3 动物雄性SD大鼠，48只，体质量240～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2007-0001。

2 方法

2.1 分组处理大鼠随机分为两组，即正常组和虚寒组，每组各24只。虚寒组每天上午8：00左右，后腿肌肉交替注射氢化泼尼松琥珀酸钠生理盐水溶液，20 mg/kg，正常组注射等体积生理盐水。注射第14、第21天晚上8点，正常组和虚寒组各12只，禁食不禁水12 h，次日上午8点，戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主静脉取血，分离血清，测乳酸（LAC）。固定位置取一块儿肝脏，4%多聚甲醛固定，每组动物按号间隔取，每组取5个标本，待测免疫组化。其余肝脏，-80℃冻存，待测SDH和ATP酶。

2.2 指标检测血清LAC由贝克曼CX4型全自动生化分析仪检测。肝匀浆中SDH、ATP酶活性，按南京建成SDH、ATP酶测试盒说明书方法检测。肝脏UCP-2蛋白表达，免疫组织化学法检测。将肝脏浸入4%多聚甲醛液中固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5 μm；常规脱蜡和水化，92～98℃水浴热修复30 min，冷却至室温，兔抗UCP-2单克隆抗体（1∶50）37℃ 2 h，二抗 37℃孵育 40 min，DAB 显色。采用Imapage-Pro Plus 6.0图像分析系统对UCP-2阳性免疫反应产物的面积及积分灰度值进行分析。

2.3 统计方法采用SAS 8.2统计软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 血清LAC变化与同期正常组比较，虚寒组大鼠血清LAC含量在造模第14天和第21天均明显降低（P<0.05）。

表1 各组动物血清LAC变化（±s）Tab.1 Change of serum LAC of animals in each group（±s） μmol/L

注：与正常组比较，*P<0.05。

氢考剂量（mg/kg，肌注）正常组 12虚寒组 12组别 n 14 d 21 d-7.64±0.55 7.18±0.8320 5.25±0.17* 5.29±0.84*

3.2 肝组织SDH变化与同期正常组比较，虚寒组大鼠肝组织匀浆中SDH活性在造模第14天和第21天均明显降低（P<0.05）。

表2 各组动物肝匀浆SDH变化（±s）Tab.2 Change of SDH in liver homogenate of animals in each group（±s）U/mg pro

注：与正常组比较，*P<0.05。

组别正常组虚寒组n 氢考剂量（mg/kg，肌注）121214 d 21 d-3.76±0.58 5.02±1.2120 3.06±0.86* 4.10±0.60*

3.3 肝组织ATP酶变化与同期正常组比较，虚寒组大鼠肝组织中Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性在造模第14天有降低趋势，Ca2+-Mg2+-ATP酶有升高趋势，均未见统计学差异；虚寒组大鼠肝组织中Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性在造模第21天均明显降低（P<0.05，P<0.01）。

表3 各组动物肝匀浆ATP酶变化比较（±s，n=12）Tab.3 Change of ATPase in liver homogenate of animals in each group（±s，n=12）

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01。

组别氢考剂量（mg/kg，肌注）Ca2+-Mg2+ATP酶- 2.36±0.41 1.50±0.27 1.67±0.55 2.61±0.5120 2.31±0.23 1.40±0.17 1.37±0.23 2.74±0.46- 3.95±0.76 4.14±0.76 3.89±0.91 4.12±0.8720 3.46±0.30*3.14±0.40**3.25±0.35*3.46±0.32*时间14 d Na+-K+ATP酶Mg2+ATP酶Ca2+ATP酶正常组虚寒组正常组虚寒组21 d

3.4 肝组织UCP-2表达变化与正常组比较，虚寒组肝脏UCP-2的阳性表达面积（Area）和积分光密度值（IOD）明显降低（P<0.05）。

表4 各组动物肝脏UCP-2蛋白表达的变化（±s）Tab.4 Change of the expression of protein of hepatic UCP-2 of animals in each group（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05。

组别正常组虚寒组n 5 5氢考剂量（mg/kg，肌注） Area IOD-23.84±3.31 4.03±0.5220 18.48±1.79* 2.64±0.52*

4 讨论

动物模型的塑造和构建，是中药药性理论实质研究的基础。虚寒状态动物模型则与辛热药药性表达研究密切相关。近年来，有关虚寒状态动物模型的研究日益增多，课题组运用数理分析方法对数百篇与虚寒动物模型相关文献进行总结，选择氢化泼尼松作为造模剂，制作虚寒状态动物模型，并经过大量研究，确定造模剂量及模型成功和稳定时间[7-8]。在课题组前期工作的基础上，本实验选择氢化泼尼松诱导虚寒状态，以肝组织中SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、肝脏UCP-2蛋白表达，血清中LAC的含量作为指标，探讨虚寒状态下肝脏能量代谢变化特点。

能量代谢指随着生命现象或作为其原因的能量的出入或转换能量代谢方面，在化学键能（呼吸、发酵）或光能（光合成）直接转化成热量前，转换成ATP等的高能键是其显著的特征之一。机体能量代谢包括能量的生成和能量的分解两部分。SDH是线粒体内三羧酸循环中的酶，其活性增高表明三羧酸循环的加快，同时也标志着细胞内ATP生成增强，LAC则是糖酵解途径的产物，也与能量的生成有关。ATP酶又称为三磷酸腺苷酶，是一类能将ATP催化水解为二磷酸腺苷（ADP）和磷酸根离子的酶，这是一个释放能量的反应，Na+-K+-ATP酶[9]、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶等酶的活性与能量代谢密切相关。王米渠等[10]研究发现寒证大鼠Na+-K+-ATP酶的活性比正常大鼠下降。张伟荣等[11]研究发现虚寒大鼠细胞能荷、肝脏Na+-K+-ATP酶活性、比虚热大鼠低。本实验结果显示，虚寒状态组血清LAC含量降低，肝组织中SDH活性降低，Na+-K+ATP酶、Mg2+ATP酶、Ca2+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活性均明显降低，提示虚寒状态大鼠能量生成环节障碍。

此外，解偶联蛋白家族（UCPs）作为一种线粒体转运蛋白，在调节机体产热和能量代谢方面发挥着重要作用。UCP通过催化质子的跨线粒体内膜运输，降低线粒体内膜两侧的质子梯度，从而降低ATP生成，使产热增加。UCP-2广泛存在于动物的骨骼肌、肝脏、肾脏、肺、胃及小肠等组织的线粒体内膜上，它主要作用是通过消除线粒体内膜两侧的质子梯度差，从而使氧化过程和ATP生成的磷酸化过程解偶联，使得氧化过程释放的能量全部以热能形式散失[12]。本实验显示，肝脏UCP-2表达降低，提示虚寒机体处在能量代谢障碍状态。

综上，虚寒状态大鼠血清LAC含量，肝组织中ATP酶活性和UCP-2表达降低。可见，氢化泼尼松诱导的虚寒状态动物模型存在能量代谢障碍。在虚寒状态模型的制作和研究中，应注意能量代谢的相关变化，然能量代谢更深层的机制尚需进一步探讨。

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