HPLC法测定苦木中3种活性成分的含量*

姚小华，匡艳辉，黄国鑫，黄 琳，林 青

（广州白云山和记黄埔中药有限公司现代中药研究院，广州 510515）

苦木为苦木科植物苦木Picrasma quassioides（D.Don）Benn.的干燥枝及叶。收载于《中国药典》2010年版一部。性寒，味苦。具有清热，祛湿，解毒之功效，用于治疗风热感冒，咽喉肿痛，腹泻下痢，湿疖，毒蛇咬伤等症[1]，是消炎利胆片等中成药的主要药材原料。苦木药材质量标准尚无定量测定项，标准亟待提高，目前却鲜见苦木药材中生物碱定量测定研究报道。苦木主要含生物碱、苦味素、苦木内酯等[2-4]，生物碱主要为铁屎米酮类生物碱、β-carboline类生物碱及二聚体生物碱[5]。据文献报道，铁屎米酮类是苦木药材的主要化学成分，具有显著的抑菌作用[6-11]。为了有效控制苦木药材质量，比较不同药用部位的差别，从药材中分离得到苦木碱乙，苦木碱己和苦木碱丁经结构鉴定并进行纯度检查，以其为对照品对苦木药材用高效液相色谱仪（HPLC）法进行定量测定研究。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪，BT214D电子分析天平（瑞士沙多利斯Sartorius公司），CP225D电子分析天平（瑞士沙多利斯Sartorius公司），SB25-12DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

苦木碱乙（自制，HPLC检测纯度：99.26%，归一化法），苦木碱己（自制，HPLC检测纯度：98.45%，归一化法）和苦木碱丁（自制，HPLC检测纯度：99.13%，归一化法），苦木药材采收于广西，经鉴定为苦木科植物苦木Picrasma quassioides（D.Don）Benn.的干燥枝及叶，乙腈为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱：采用Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）－0.2%磷酸（B）梯度洗脱 0～35 min，5%A→45%A，35～40 min，45%A→80%A，40～50 min，80%A→90%A，50～60 min，90%A→95%A，流速：1mL/min，检测波长：210 nm，柱温：30 ℃。进样量：10 μL。HPLC色谱图见图1。

图1 苦木药材和对照品溶液的图谱Fig.1 Atlas of Picrasma quassioides and control solution

2.2 对照品溶液的制备 分别取苦木碱乙、苦木碱己、苦木碱丁3种对照品适量，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇制成1 mL含苦木碱乙10 μg、苦木碱己 30 μg，苦木碱丁 20 μg的溶液，即得。4 ℃冰箱中保存，备用。

2.3 供试品溶液的制备 取苦木药材粗粉约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定质量，回流提取1.5 h，放冷，加80%甲醇补足减失的质量，摇匀，取上清液，采用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性范围考察 精密吸取上述3个成分的对照品溶液各 1、2、5、10、15、30 μL，在上述色谱条件下,分别进样进行测定。以峰面积Y赞为纵坐标，进样量X（μg）为横坐标进行线性回归，结果苦木碱乙、苦木碱己、苦木碱丁回归方程、相关系数和线性范围，见表1。

表1 3个成分的回归方程、相关系数和线性范围Tab.1 Regression equation and correlation coefficient and the linear range of the 3 components

2.5 精密度实验 取同一苦木药材供试品溶液，连续进样6次，每次10 μL，记录苦木碱乙、苦木碱己、苦木碱丁的峰面积，计算精密度，RSD=0.19%、RSD=0.14%、RSD=1.00%，表明方法精密度好,见表2。

表2 3个成分的精密度实验结果Tab.2 The results of precision test of 3 components

2.6 稳定性实验 取同一苦木药材供试品溶液，分别于配制后的 0，3，6，9，12，24 h 进样，每次 10 μL，测定苦木碱乙、苦木碱己、苦木碱丁的峰面积积分值，RSD=0.81%、RSD=0.45%、RSD=2.09%。表明处理后的样品在1 d内稳定。见表3。

表3 3个成分的稳定性实验结果Tab.3 The results of stability test of 3 components

2.7 重复性实验 精密称取苦木药材粉末（过四号筛）约1.0 g，共6份，按2.3.1项下制备样品，测得苦木碱乙、苦木碱己、苦木碱丁平均含量的相对标准偏差分别为RSD=2.82%、RSD=1.00%、RSD=2.06%。见表4。

表4 3个成分的重复性实验结果Tab.4 The results of reproducibility test of 3 components

2.8 准确度实验 分别取已知含量的苦木药材粉末样品约0.5 g，精密称定，准确加入一定量的苦木碱乙、苦木碱己、苦木碱丁，按2.3项下制备供试品溶液，按2.1项条件测定，计算苦木碱乙、苦木碱己、苦木碱丁的平均回收率，结果见表5。

2.9 不同批次产地的苦木药材测定 分别取5个不同批次和产地的苦木药材粉末样品约1.0 g，精密称定，按2.3.1项下制备样品，测得苦木碱乙、苦木碱己、苦木碱丁平均含量，结果见表6。

3 讨论

苦木药材中的有效成分为生物碱，苦木碱乙，苦木碱己，苦木碱丁为其中主要成分[11]，目前未见这3种生物碱同时进行含量测定的研究报道，经紫外扫描测定其最大吸收波长均为210 nm末端吸收，对不同的流动相体系进行摸索后确定以乙腈-0.2%磷酸为流动相梯度洗脱分离，以上3种生物碱与其他峰基线达到完全分离。

含量测定结果显示，苦木药材中苦木碱己（4-甲氧基-5-羟基-铁屎米酮）含量较高，苦木碱乙（1-甲氧甲酰-β-咔巴啉）和苦木碱丁（4，5-二甲氧基-铁屎米酮）含量较低，个别批次的苦木药材未检测到苦木碱丁，不同批次的苦木药材中3种生物碱的含量相差也较大。苦木制剂系苦木干燥枝或茎加工而制成，经测定，茎和枝中苦木碱己和苦木碱丁含量相差很大[11]，因此，有必要对苦木原药材进行质量控制，以保证制剂质量稳定均一。

表5 苦木药材加样回收率测定结果(n=6)Tab.5 The results of recovery test of Picrasma quassioides(n=6)

表6 不同批次产地的苦木药材测定结果Tab.6 The results of samples of different batches of Picrasma quassioides mg/g

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