山羊乳酪蛋白酶解条件优化及其抗菌活性研究

苏晋文，李志成，任娇，郝洁，付芒娟

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌712100)

0 引 言

抗菌肽是存在于生物体内能抵抗外界微生物侵害，消除体内突变细胞的一类由基因编码或经大分子蛋白质水解产生的小分子多肽[1]，具有广谱抗细菌、真菌、病毒、和寄生虫的活性，且不易产生耐药性[2-3]，是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌物质。

乳酪蛋白在酶解过程中可以产生多种生物活性肽[4-5]，在牛乳酪蛋白酶解物中已经发现多种抗菌肽[6-8]。山羊乳是北方仅次于牛乳的第二大乳源，山羊乳酪蛋白和牛乳酪蛋白在蛋白质质量分数、氨基酸序列等方面存在较大差异[9-11]，以山羊乳酪蛋白为原料同样能获得多种活性肽[12-13]。目前对山羊乳酪蛋白抗菌肽的研究鲜见报道。本研究以山羊乳酪蛋白为原料，探索山羊乳酪蛋白抗菌肽的最适酶解条件，为山羊乳的高值化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无抗山羊乳，购于西北农林科技大学畜牧场；沙门氏菌(Salmonella LT2)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 26111)、大肠杆菌(Escherichia coli ACTT25922)，西北农林科技大学食品科学与工程学院保存。

考马斯亮蓝G-250，胰蛋白酶(80 000 U/g)，碱性蛋白酶(8 000 U/g)，木瓜蛋白酶(40 000 U/g)，中性蛋白酶(40 000 U/g)，胃蛋白酶(3 000～3 500 U/g)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1700双光束紫外光分光光度计，PK121R型低温冷冻离心机，水浴锅，SB5200DT超声清洗机，ES315高压蒸汽灭菌锅，PYX-DHS-40×50-BS-П隔水式恒温培养箱(HES-380)；SW-CJ-1F超净工作台。

1.3 乳酪蛋白制备

新鲜无抗山羊乳4℃条件下，5 000 r/min离心20 min脱脂，离心后的溶液用浓度为2 mol/L的HCl溶液调节pH值至4.3，在40℃水浴锅中静置30 min沉淀酪蛋白，沉淀完全后5 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用浓度为50 mmol/L(pH=4.4)HAc-NaAc缓冲液洗涤所得沉淀2～3次，洗涤后5 000 r/min离心10 min，即得酪蛋白粗品。

1.4 酪蛋白酶解液制备

称取适量酪蛋白于三角瓶，加浓度为0.1 mol/L的NaOH助溶，定容，沸水浴加热10 min，杀菌。冷却后，放入60℃的恒温水浴锅中，等到酶解液温度与水浴锅温度一致，调节溶液pH值至最适，并准确加入蛋白酶。水解过程不断滴加浓度为1 mol/L的NaOH，维持反应体系pH值恒定，到达规定酶解时间后，沸水浴加热灭酶10 min，冷却离心，取上清液备用[14]。

1.5 蛋白酶的筛选

[15]和[16]中的方法，分别采用中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和胃蛋白酶在表1所示的条件下酶解山羊乳酪蛋白，根据酶解液对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌抑菌圈直径大小筛选出抑菌效果最好的蛋白酶。

表1 5种蛋白酶的酶解条件

1.6 酶解条件优化

1.6.1 单因素实验

(1)时间的确定。在酶解温度为60℃，pH值为5.5，加酶量为 4 500 U/g，底物浓度为60 g/L的反应体系下，以时间为0.5 h和1.5～5.5 h做单因素实验，以酶解液抑菌圈直径大小为指标，确定适宜酶解时间。

(2)加酶量的确定。选用适宜酶解时间，在酶解温度为60℃，pH值为5.5，底物质量浓度为60 g/L的反应体系下，按 2 000 U/g和3 000～7 000 U/g加入木瓜蛋白酶，以酶解液抑菌圈直径大小为指标，确定适宜酶用量。

(3)底物质量浓度的确定。选用适宜酶用量和酶解时间，分别在底物质量浓度为4，6，8，10，12 g/L的条件下酶解酪蛋白，以酶解液抑菌圈直径大小为指标，确定适宜底物质量浓度。

(4)pH值的确定。选用适宜酶用量、酶解时间和底物质量浓度，分别在pH值为3，4，5，6，7和8条件下进行酶解，以酶解液抑菌圈直径大小为指标，确定适宜酶解pH值。

1.6.2 正交实验

根据单因素实验得到的最适条件，以底物浓度、加酶量、pH值、酶解时间为实验因素，按照L9(34)进行正交实验，以酶解液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈直径为指标，确定木瓜蛋白酶酶解羊乳酪蛋白的最佳工艺条件。

1.7 检测指标及方法

1.7.1 酪蛋白质量分数测定

采用微量凯氏定氮法[17]测定蛋白质质量分数。测得山羊乳酪蛋白蛋白质质量分数为18.78%。

1.7.2 抑菌活性测定

本研究指示菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。

(1)培养基制作。称取牛肉膏5.00 g，胰蛋白胨10.00 g，NaCl为5.00 g， 琼脂10～12 g， 蒸馏水加热溶化，冷却，定容至1 000 mL，调节pH值为7.2～7.4。

(2)菌种活化。无菌操作条件下用接种环将斜面保藏的菌种接种于灭好菌的营养琼脂斜面上，37℃培养24 h，连续接种两代，于4℃冰箱中备用。

(3)菌悬液的制备及活菌计数。无菌条件下，用生理盐水将活化的菌种从斜面洗下，震荡均匀进行逐级稀释，取100 μL进行平板涂布，37℃倒置培养培养16～24 h，进行菌落计数，计算原液浓度。

(4) 标准曲线绘制。 将原液按2，3，4，6，8，9，10，50，100的倍数稀释，在560 nm处测定各稀释液OD值，以不同稀释度的菌落数为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。对照标准曲线吸光度，调整菌液浓度最终为107mL-1，3种菌吸光值与菌液浓度标准曲线如图1所示。

(5)抑菌活性测定

参考文献[18]和[19]中的方法，测定试样对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌圈直径。具体方法为：在无菌条件下，取107mL-1的菌液100 μL均匀涂布于营养培养基上，在超净工作台中静置20 min，待菌液吸收后用无菌的外径为8 mm的小钢管在琼脂平板上挖洞，每孔加入90 μL样品溶液，水平置于4℃冰箱中约2 h让样品溶液完全扩散，再移至37℃恒温培养箱中培养15～24 h，观察结果，有抑菌圈出现的样品，以游标卡尺量其取抑菌圈的直径。

1.8 数据处理

采用SPSS19.0软件进行结果统计分析，结果以平均值±标准偏差(±s)的形式表示，每组试验进行3～6个重复，必要时进行方差显著性比较。

2 结果分析

2.1 山羊乳酪蛋白水解酶的筛选

5种蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白酶解液对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最佳抑菌效果见表2。

由表2可以看出，阳性对照青霉素对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有显著抑制作用，碱性蛋白酶酶解物对大肠杆菌，中性蛋白酶酶解物对沙门氏菌，胰蛋白酶酶解物对金黄色葡萄球菌均无抑菌活性。相比而言，木瓜蛋白酶酶解物对3种菌的抑菌效果均较好，与其他四种酶解物对3种菌的抑菌圈直径存在显著性差异(P<0.05)。因此，确定木瓜蛋白酶为山羊乳酪蛋白的最佳水解用酶。

图1 菌液吸光值与其浓度的标准曲线

表2 山羊乳酪蛋白酶解物的抑菌效果(±s，n=3)

表2 山羊乳酪蛋白酶解物的抑菌效果(±s，n=3)

注：青霉素质量浓度为1 250 mg/L；小写字母不同表示差异性显著(P<0.05)；琼脂孔直径8.0 mm；-为没有抑菌圈。

菌株大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌中性蛋白酶酶解物8.2±0.1c―8.3±0.2c胰蛋白酶酶解物8.4±0.2c 8.2±0.2c―木瓜蛋白酶酶解物9.3±0.2b 9.4±0.1b 9.4±0.3b抑菌圈直径/mm菌株大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌碱性蛋白酶酶解物―8.4±0.1c 8.3±0.2c胃蛋白酶酶解物8.6±0.1c 8.5±0.2c―生理盐水―――青霉素40.3±0.5a 43.3±0.5a 43.0±1.0a抑菌圈直径/mm

2.2 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的单因素实验

2.2.1 酶解时间

在酶解温度为60℃，pH 值为5.5，加酶量为4 500 U/g，底物浓度为60 g/L的反应体系下，改变酶解时间，不同酶解时间对酶解液抑菌效果的影响结果如图2。

图2 时间对山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性影响

由图2可以看出，在2.5 h之前，随着时间的延长，酶解液对3种菌的抑菌圈直径逐渐增大，说明酶解时间小于2.5 h，酪蛋白没有被完全水解，随着水解时间的延长水解度增加，具有活性的多肽浓度不断升高；而2.5 h之后，抑菌圈的直径随时间延长而减小，可能是因为酪蛋白被完全水解后，具有抑菌活性的多肽被继续酶解成不具抗菌活性小肽，使原来生成的抗菌肽的量减少。2.5 h时抑菌效果达到最高，说明此时酶解液中抗菌肽浓度最高，为最佳酶解时间。

2.2.2 加酶量的影响

在给定条件酶解温度60℃，底物质量浓度60 g/L，酶解时间2.5 h，pH值为5.5时，加酶量对山羊乳酪蛋白酶解物抑菌活性影响如图3所示。

图3 加酶量对山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性影响

由图3可以看出，加酶量在2 000～5 000 U/g之间，酶解液对3种菌的抑菌圈直径随加酶量的增加而增大，在5 000 U/g之后，抑菌圈直径随加酶量的增加而减小。加酶量在5 000 U/g之前，随着酶用量的增加，酶与底物的比例逐渐增大，单位时间内木瓜蛋白酶结合酪蛋白并催化反应生成的抗菌肽的量也逐渐增多；在5 000 U/g之后，随着加酶量的增大，体系内开始形成酶多底物少的局面，一方面，蛋白酶之间形成竞争关系，使酶解程度降低，另一方面未能与酪蛋白结合的酶会酶解水解产物，使抗菌肽的量减少，从而降低抑菌活性。加酶量为5 000 U/g时对3种菌的抑菌效果达到最高，为最适加酶量。

2.2.3 底物质量浓度的影响

在酶解温度为60℃，加酶量5 000 U/g，pH值为5.5的反应体系下，酶解山羊乳酪蛋白2.5 h，底物质量浓度对山羊乳酪蛋白酶解物抑菌活性影响如图4所示。

图4 底物质量浓度对山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性的影响

由图4可以看出，在底物质量浓度为40～80 g/L时，酶解物对3种菌的抑制作用随底物质量浓度的增加而增大，根据单底物酶促反应动力学理论，底物质量浓度较低时，酶解液水解程度随底物质量浓度增加而增大，水解产生的具有抗菌活性的多肽浓度增大，酶解液对3种菌抑菌作用也较大；而在底物质量浓度大于80 g/L时，抑菌圈直径减小，说明当底物质量浓度超过80 g/L后，体系开始出现底物抑制现象。因此，以80 g/L为最适底物质量浓度。

2.2.4 pH值的影响

在酶解温度60℃，酶解时间2.5 h，加酶量5 000 U/g和底物质量浓度为80 g/L的条件下，pH值对酶解物抑菌活性的影响如图5所示。

由图5可以看出，随着反应体系内pH值的增大，酶解物对3种菌的抑菌圈直径呈现先增大后减小的趋势，在反应体系中，酶解酪蛋白的水解酶的空间构象受pH值的影响较大，在过酸过碱的环境下，水解酶的空间构象会改变使其降低其活性，从而生成的抗菌肽的量也降低。因此，反应体系最适合pH值确定为6.0。

图5 pH值对羊乳酪蛋白酶解液抑菌活性的影响

2.2.5 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交实验

根据单因素实验得到的最适条件，用L9(34)正交实验对加酶量、底物浓度、酶解时间和pH值进行正交实验，通过正交实验确定酶解山羊乳酪蛋白的最佳工艺条件。正交实验的设计与结果分析如表3所示。

表3中，R值最大的为pH值，其次为加酶量，然后是酶解时间，底物质量浓度R值最小。可见，实验中各因素对酶解产物抑菌活性的影响的主次顺序为D＞B＞A＞C，即pH值＞加酶量＞酶解时间＞底物质量浓度。ki值显示木瓜蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白的最佳工艺组合为A1B2C2D2，即在60℃下，酶解时间为1.5 h，加酶量为5 000 U/g，底物质量浓度8%，pH值为6.0，恰为正交实验第2组。

表3 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交设计与结果分析

2.3 讨论

(1)山羊乳酪蛋白的木瓜蛋白酶酶解物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈分别为10.5 mm，10.3 mm和10.5 mm，这与一些牛乳酪蛋白酶解物的抑菌圈相比，直径比较小，如胡志和等人利用胰蛋白酶解牛乳酪蛋白，获得抗菌肽对大肠杆菌的抑菌圈直径为19.5 mm[7]；付莉等人利用中性蛋白酶水解酪蛋白所得抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为21.93 mm[20]。这可能与本试验用于制备的酪蛋白为粗品(酪蛋白浓度为18.78%)，酶解底物纯度较小有关。

(2)熊清权等人[21]利用木瓜蛋白酶酶解牛乳酪蛋白制备抗菌肽，确定酶解的最佳时间为4.5 h，而本试验最佳酶解时间为1.5 h，相差较大，这可能与山羊乳酪蛋白与牛乳酪蛋白自身性质有关，Jainska研究表明，在体外用胰蛋白酶酶解酪蛋白，羊乳酪蛋白有96%被水解，而牛乳酪蛋白只水解了70%～90%[22]；在人的胃液和十二指肠液的作用下，30 min内只有23%的羊乳酪蛋白未被水解，而牛乳酪蛋白还有83%未被水解[23]。说明羊乳酪蛋白比牛乳酪蛋白存在更大的溶解性，更易被酶解。

表3木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交设计与结果分析。

(3)单因素试验和正交试验结果相比，酶解时间不一致，单因素试验时最适酶解时间为2.5 h，而正交试验为1.5 h，这是因为在做单因素试验时，首先考虑了酶解时间，加酶量、pH值和底物质量浓度均为选酶时设定的初始条件，也就是说2.5 h是在其他因素为初始条件下得到的较好的结果，与做正交试验时各因素的优化条件不一样，优化试验证明，酶解1.5 h，酶解物抗菌效果更佳。

3 结 论

(1)木瓜蛋白酶是山羊乳酪蛋白的最佳水解用酶，其酶解物对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强。

(2)木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的最佳工艺为加酶量为5 000 U/g，底物质量浓度80 g/L，pH值为6.0，在60℃酶解1.5 h，所得酶解液对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌圈直径均在10.5 mm左右。

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