苹果树腐烂病菌胞外蛋白提取方法

王海英 何媛媛 黄丽丽 韩青梅

（1.西北农林科技大学植物保护学院，杨凌 712100；2.旱区作物逆境生物学国家重点实验室，杨凌 712100；3.西北农林科技大学理学院，杨凌 712100）

苹果树腐烂病（Apple valsa canker）是苹果生产中危害最严重的病害，由黑腐皮壳真菌Valsa maliMiyabe & Yamade引起［1，2]。目前我国和日本已经就病菌的扩展定植［3]主要的致病物质［4-6]等问题进行了研究，但仍没有充分证据证明病菌产生的哪些胞外物质与致病性密切相关，对其致病机制了解甚少。因此，深入研究苹果树腐烂病菌的致病物质及其产生机制可为有效防治病害提供科学依据。

蛋白质组学已广泛应用于病原与寄主互作的研究中，它可以将基因组序列信息和在特定条件中执行生命功能的蛋白质有机地联系起来，并全面检测不同组织器官所表达的蛋白质及在不同发育阶段、不同条件下蛋白质表达的差异。iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation）是蛋白质组学领域一项新的同位素标记技术，它克服了二维电泳（2-DE）对低丰度蛋白、膜蛋白、偏碱蛋白，分子量偏大或偏小蛋白的分离和检测困难的缺点［7]，蛋白定量更准确，但该技术对样品的蛋白含量和质量要求较高，限制了该技术在低表达的胞外蛋白上的应用和发展［8]。目前胞外蛋白提取方法有：发酵液冷冻干燥法［9]，这种方法适用于高含量胞外蛋白的提取；有机溶剂沉淀法，这种方法弊端是至少加入3倍发酵液体积的有机溶剂［10]，不适合大体积发酵液中胞外蛋白提取。本试验中苹果树腐烂病菌Valsa mali在正常生长状态下分泌的蛋白较少，分离沉淀困难。因此，建立一种高效的胞外蛋白质提取方法，以获取种类和数量较多的胞外蛋白是该菌进行胞外蛋白质组学实验的重要前提。

本研究通过比较液体发酵培养条件下2种蛋白提取方法对苹果树腐烂病菌胞外蛋白的提取效率，选择其中能够提取尽可能多的高质量的胞外蛋白的方法，旨在为后续苹果树腐烂病菌胞外蛋白质组学的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用苹果树腐烂病菌野生型菌株8#由本实验室分离获得并于-80℃冰箱保存。蛋白质组学试剂均购自MP公司，其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 直接冷冻干燥/透析 参照常明等［11]的方法，略有改动。将500 mL发酵滤液分装于50 mL的离心管中，冷冻干燥至粉末。粉末用MilliQ水重新溶解，将重新溶解的溶液在MilliQ水中进行透析（4℃，约24 h），4℃、5 000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清液再次冷冻干燥（-104℃ 约48 h）。最后用水化上样缓冲液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.065 mol/L CHAPS，0.1 mol/L DTT，0.001% Bio-Lyte）重新悬浮，放于-80℃备用。

1.2.2 DOC-10%TCA沉淀法 参照Schwarz等［12]的方法略有改动，向500 mL发酵滤液中均匀加入DOC至其终浓度为0.02%（W/V），处理后的滤液冰上静置30 min，然后缓慢滴入已配好 10%（W/V）的TCA，同样冰上静置30 min后4℃、10 000 r/min离心10 min，去掉上清，并用96%冰乙醇彻底清洗沉淀，重复上述离心及清洗过程2-3次；最后清洗后的沉淀用水化上样缓冲液（同1.2.1）重新悬浮，放于-80℃备用。

1.2.3 硫酸铵沉淀法 5份500 mL发酵滤液置于冰浴环境，260 r/min搅拌，少量缓慢加入硫酸铵粉末，分别至硫酸铵终浓度为50%、60%、70%、80%和90%，沉淀过夜；4℃、10 000 r/min离心30 min［10]，沉淀用磷酸缓冲液溶解后装入已处理的透析袋并置于MilliQ水中透析，BaCl2检测无沉淀后，将蛋白粗提液4℃、5 000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清液冷冻干燥，蛋白干粉用水化上样缓冲液（同1.2.1）重新悬浮，-80℃保存。

1.2.4 蛋白粗品质量及蛋白含量的测定 不同方法获得的蛋白粗品冷冻干燥至恒重后称重。利用水化上样缓冲液（同1.2.1）溶解蛋白粗品，Bradford法［13]测定蛋白溶液浓度并计算总蛋白量。标准品为牛血清白蛋白（1 mg/mL），根据不同浓度标准品在595 nm 波长处的吸光度值绘制标准曲线，得到计算公式，即可算出蛋白质浓度，并进一步计算溶液中总蛋白量。然后由蛋白粗品质量和Bradford检测到的总蛋白量计算蛋白相对含量，数据由3次生物学重复试验获得，并经过SPSS16.0软件中Duncan模型进行P=0.05水平的显著性分析。

1.2.5 蛋白样品SDS-PAGE电泳检测 硫酸沉淀法中蛋白获得量最高的样品与冷冻干燥/透析法、DOC-10%TCA法的蛋白样品进行12% 分离胶，5%浓缩胶的SDS-PAGE，考马斯亮蓝G-250染色，比较蛋白样品的电泳图谱的分辨率。

1.2.6 野生菌株8#及其突变体X900的SDS-PAGE条带差异比较 选择3种方法中提取效率最高的方法提取苹果树腐烂病菌野生型强致病菌株8#及其不致病突变体X900的胞外蛋白，实验经过3次生物学重复获得蛋白样品进行12% SDS-PAGE电泳，分析同一菌株不同批次提取的蛋白样品的重复性，以及不同菌株的胞外蛋白之间SDS-PAGE图谱差异。

2 结果

2.1 胞外蛋白粗品质量及蛋白含量分析比较

冷冻干燥/透析法、DOC-10%TCA沉淀法及不同浓度硫酸铵沉淀法提取的蛋白粗品称重、Bradford法检测的蛋白总量并根据1.2.5中公式计算蛋白相对含量，在P=0.05水平进行差异显著性分析结果如表1所示，50%-80%硫酸铵终浓度沉淀获得的蛋白粗品质量随硫酸铵浓度提高而显著增加，而至90%时蛋白粗品质量未明显增加；DOC-10%TCA与50%硫酸铵沉淀获得的蛋白粗品质量最少，无显著差异；冷冻干燥/透析法获得的粗蛋白质量最高。利用Bradford法检测粗蛋白中蛋白总量，结果表明70%硫酸铵沉淀的蛋白粗品中蛋白总量明显高于其他硫酸铵浓度以及冷冻干燥/透析法和DOC-10%TCA法，而蛋白相对含量与DOC-10%TCA沉淀法无明显区别，在所有方法中最高。

表1 不同方法获得蛋白粗品质量及蛋白定量结果

2.2 冷冻干燥/透析、DOC-10%TCA、70%硫酸铵提取的样品SDS-PAGE电泳

将冷冻干燥/透析法、DOC-10%TCA法及70%硫酸铵沉淀法获得的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，结果（图1）显示，70%硫酸铵沉淀的蛋白（b1、b2）可辨认条带最多，而且浓度较高。在14.4-25.0 kD范围内，冷冻干燥/透析法蛋白样品（a1、a2）几乎没有条带，DOC-10%TCA法提取的样品有蛋白条带，但可辨认的蛋白条带较少，而70%硫酸铵沉淀的蛋白样品（b1、b2）条带较多，分辨率和浓度较高；在25-66.2 kD分子量范围内冷冻干燥/透析法提取的样品蛋白条带比较清晰，图中箭头A所指的蛋白浓度较高，但条带数量较少，总蛋白浓度很低，DOC-10%TCA法提取的蛋白样品条带较前者多，但分辨率低，70%硫酸铵沉淀的蛋白样品条带最多、分辨率最高，只是接近66.2 kD大小处的蛋白条带B浓度低于A条带；大于66.2 kD分子量范围内，冷冻干燥/透析的蛋白样品条带很少且非常微弱，70%硫酸铵和DOC-10%TCA获得的蛋白样品中的条带相对较多，但分辨率均较低。

图1 三种方法提取的蛋白样品SDS-PAGE电泳

2.3 不同致病菌株胞外蛋白SDS-PAGE比较

采用70%浓度硫酸铵提取8#及其不致病突变体菌株X900发酵液中的胞外蛋白，3次重复试验获得的蛋白样品进行12% SDS-PAGE电泳，电泳部分图谱（图2）显示，该提取方法获得的蛋白样品分辨率较高、重复性较好。两株菌的差异蛋白条带明显，3个蛋白条带a、b、c只在8#（4、5、6泳道）中存在，在突变体X900（1、2、3泳道）中缺失；而图中蛋白条带d在突变体X900中表达，在野生型8#未表达。

图2 强弱致病菌株胞外蛋白SDS-PAGE电泳

3 讨论

冷冻干燥/透析法是一种简单、方便的胞外蛋白质提取方法。Medina等［9]在分析黄曲霉外泌蛋白质组学时利用冷冻干燥法获得较多的黄曲霉外泌蛋白，电泳图谱效果比较理想。本试验用该方法获得的蛋白样品经Bradford定量，结果显示蛋白含量很高，而SDS-PAGED电泳条带少而弱，原因可能是黄曲霉外泌蛋白表达较高，简单的冷冻干燥法能够提取足够多的胞外蛋白。苹果树腐烂病菌胞外蛋白分泌很少，提取的粗蛋白干粉未经过沉淀分离，蛋白粗品中培养基成分，如可溶性淀粉较多，蛋白含量很低，导致蛋白干粉溶解时呈黏稠状，过高估计了蛋白定量结果［14]。

DOC-10%TCA沉淀法是较为常用的胞外蛋白样品制备技术，Schwarz等［12]利用DOC-10%TCA沉淀法获得的丙酮丁醇梭菌的胞外蛋白质量明显好于PEG6000和丙酮沉淀两种方法。常明等［11]在探索稻瘟病菌胞外蛋白提取方法时也证明DOC-10%TCA沉淀法比冷冻干燥法更适合稻瘟病菌的胞外蛋白的提取。本实验中用该方法提取的苹果树腐烂病菌胞外蛋白虽然浓度较高，但蛋白样品分辨率很低，可能原因是TCA沉淀了实验所用培养基中的某些成分，样品需要进一步纯化，所以如果将该方法用于本实验胞外蛋白的提取，有待对蛋白样品作进一步纯化以提高样品分辨率。

硫酸铵沉淀法是一种经典的蛋白质提取方法，Jiang等［10]比较了TCA沉淀、丙酮沉淀、超滤、硫酸铵沉淀及氯仿/甲醇5种蛋白提取方法对人体血浆蛋白的提取效果，结果表明5种提取方法电泳图谱效果没有明显差异，但是有机溶剂沉淀时使用的有机试剂至少是3倍发酵滤液体积［10]，离心工作量增加，不适合用于大体积发酵液蛋白质的提取。同时在探索沉淀血浆蛋白的理想硫酸铵浓度时，70%硫酸铵沉淀的血浆蛋白量是50%硫酸铵浓度的2倍多，这点与本实验结果一致。本实验运用70%硫酸铵盐析法提取Valsa mali胞外蛋白，蛋白含量和分辨率最高。继续增加硫酸铵浓度可能导致发酵液中其他大分子物质一起沉淀，增加了蛋白粗品的质量，原本沉淀的某些蛋白随硫酸铵浓度增加溶解度改变，重新复溶，导致蛋白含量降低。本实验在硫酸铵沉淀后避免用导致蛋白损失的冰丙酮洗涤法对蛋白进行纯化［10]，而是增加了透析、低速离心去除盐离子和不溶性多糖，从而保证了较高的蛋白回收率和分辨率。

4 结论

本试验通过比较 3 种蛋白提取方法获得的胞外蛋白粗品质量和蛋白含量，以及 SDS-PAGE 电泳图谱分析，初步明确 70% 硫酸铵沉淀的胞外蛋白粗品中蛋白总量及相对含量较为理想、SDS-PAGE 电泳图谱分辨率最高，且重复性好。用该方法提取的不同致病力的苹果树腐烂病菌的胞外蛋白 SDS-PAGE电泳图谱差异明显。由此证明，该方法更适合苹果树腐烂病菌胞外蛋白差异比较时蛋白的提取。

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