不同环境因子对爪哇伪枝藻分泌胞外多糖的影响

饶本强，张继英，娄亚敏，梅海霞，王艳璐

(1.信阳师范学院 生命科学学院,河南 信阳 464000; 2.信阳农林学院 生物技术系,河南 信阳 464000)

0 引言

多糖作为生物信息分子和功能分子的提出，它们的生理活性、化学结构以及工业化应用成为研究热点[1].微藻胞外多糖(Extracellular polysaccharides，EPS)是由藻类在生长过程中分泌到细胞外的水溶性多糖.这些释放的水溶性EPS能够很容易地从培养液中获取，应用于许多工业领域.目前对藻类EPS的研究，主要集中在淡水微藻和海洋微藻多糖的提取、分离纯化和活性功能及其应用等方面.研究较多的有螺旋藻(Spirulinasp.)、盐藻(Dunaliellasalina)、小球藻(Chlorellasp.)和紫球藻(Porphyridiumcruentum)等[2].来自荒漠地表的土壤丝状微藻，其胞外多糖是在极端环境条件下产生的次生代谢产物，具有抗辐射、抗干旱和抗盐碱等多种生态学功能[3].特别是近年来研究发现了荒漠蓝藻EPS抗肿瘤和抗衰老等功效，显示了在医药领域的潜在应用价值[4]，如免疫调节作用[5-7]、抗肿瘤[8-9]、抗病毒[10-11]、抗氧化与抗辐射[12-13]等.研究发现，许多荒漠丝状蓝藻在生长过程中能产生大量的EPS，相对其他藻类要高得多[14].以往对荒漠土壤微藻EPS的研究多集中在多糖组成、结构和在荒漠生态功能方面，但有关荒漠微藻EPS合成的影响因素研究方面相对比较薄弱.本文以一种典型的荒漠丝状蓝藻——爪哇伪枝藻为实验材料，研究了不同环境因子对荒漠蓝藻合成EPS的影响.

1 材料与方法

1.1 藻种培养

爪哇伪枝藻(Scytonemajavanicum(Kütz.) Born et Flah)从荒漠土壤中分离、纯化所得.采用BG-110液体培养基、光照强度40 μE·m-2·s-1，24 h连续光照，25±1 ℃，三角瓶中通气培养至对数生长期(10 d)，用作下列试验处理.

1.2 试验处理

温度试验：在光照培养箱中设置5 ℃、25 ℃、35 ℃进行温度处理，光照度2000 lx，光周期为12 h∶12 h.

测定盐度(NaCl)、pH值、培养时间对S.javanicum胞外多糖分泌的影响.盐度试验采用0.05、0.20、0.40 mol/L NaCl处理.pH试验中，将BG-110基础培养基pH分别调至5.5、7.5、11.5.培养时间试验中，分别设置不同培养时间(5、15、30、45、60、90 d).上述试验于温室条件下，(23±1) ℃，光强30 μE·m-2·s-1，24 h 连续光照，静置培养.

上述各种处理均在100 mL三角瓶中进行，按接种量5%的比例将S.javanicum接种到盛有80 mL培养基的三角瓶中，然后培养20 d后取样测定各种处理下S.javanicum分泌胞外多糖的含量.培养时间试验中，按照相应的时间取样测定胞外多糖.每种处理设定3个平行.

1.3 实验测定

1.3.1 葡萄糖标准曲线测定

配制40 mg/L的葡萄糖标准液，分别取不同体积的葡萄糖标准液，加蒸馏水补足至2.0 mL稀释成不同的葡萄糖浓度梯度，然后向各梯度中分别加入1 mL 9%的苯酚，摇匀，再加入5 mL浓硫酸，摇匀，反应总体积8 mL.在室温下放置30 min，测定OD490(以不加糖反应液作空白对照)，以葡萄糖含量为纵坐标，吸光值OD490为横坐标绘制标准曲线.

1.3.2 胞外多糖分泌量测定

各种环境因子处理下的S.javanicum胞外多糖分泌量测定采用苯酚-硫酸比色法[15].根据葡萄糖曲线计算出培养液中胞外多糖分泌量(mg/L).

1.3.3 胞外多糖粗品分析

将S.javanicum培养35 d 后离心，得到上清液，将上清经过0.45 μm 微孔滤膜过滤，得脱细胞培养液.将脱细胞培养液用旋转蒸发仪于40 ℃减压浓缩至500 mL，加3倍体积的无水乙醇于浓缩液中得白色絮状沉淀，离心收集并用乙醇和丙酮重复洗涤2次，干燥，得胞外多糖粗提物.将胞外粗多糖称干质量，采用苯酚-硫酸法测定糖含量，并计算提取率.

1.4 显微结构与超微结构观察

取离心收集的藻体溶于新鲜的BG-110培养基中，于Nikon Eclipse E600光学显微镜(目镜10×，物镜40×)下观察S.javanicum细胞形态，用OLYMPUS显微摄影系统照相.分别取25 ℃和35 ℃处理的S.javanicum藻体适量，经固定、脱水、包埋处理后，用LKB-NOVA 型超薄切片机切片.在厌氧条件下，饱和醋酸铅双氧铀和柠檬酸铅双染色，以Tecnai型透射电镜观察细胞壁和细胞内部结构的变化.

1.5 数据分析

采用统计分析软件SPSS 13.0 对实验数据进行单因素方差分析.多重比较采用Duncan法进行，用大写字母表示不同处理之间的差异达到显著性水平(p<0.05)，用双星号(**)表示极显著性水平(p<0.01).文中所有数据均重复3次，表示为平均值±标准差(用误差线显示).

2 结果与分析

图1为测定的葡萄糖标准曲线.横坐标表示吸光度值OD490，纵坐标代表葡萄糖质量(mg).将标准曲线拟合为线性方程：y=0.165 4x+0.001 3(R2=0.996 4)，用于计算各种处理下S.javanicum胞外多糖分泌量.

图1葡萄糖标准曲线

Fig. 1ThestandardcurveofGlueose

2.1 温度对爪哇伪枝藻分泌胞外多糖的影响

如图2所示，在光照培养箱5 ℃和25 ℃处理下，经过20 d培养后，S.javanicum胞外多糖分泌量无显著性差异(p>0.05)，且均维持在较低的分泌量.35 ℃处理时，S.javanicum胞外多糖分泌量急剧增大，达到246.5 mg/L，极显著高于5 ℃和25 ℃处理(p<0.01)，分别为5 ℃和25 ℃处理时胞外多糖分泌量的7.36倍和5.98倍.结果表明，适当的高温非常有利于S.javanicum分泌胞外多糖，而较低的温度则明显抑制S.javanicum胞外多糖的分泌.

图2温度对伪枝藻胞外多糖分泌的影响

Fig. 2EffectsoftemperatureonEPSexudationofS.javanicum

2.2 盐度对爪哇伪枝藻分泌胞外多糖的影响

图3表明，在温室条件下S.javanicum胞外多糖分泌量随盐浓度的增大而呈现增大趋势.在培养液中，当NaCl浓度为0.2 mol/L时，S.javanicum胞外多糖分泌量达到最大值(51.2 mg/L)，极显著高于0.4 mol/L 盐度(p<0.01)，显著高于0.05 mol/L盐度处理(p<0.05).在BG-110基础培养基处理下，S.javanicum胞外多糖分泌量与0.05 mol/L盐度处理无显著性差异(p>0.05).这表明，一定范围的高盐度能显著促进S.javanicum分泌胞外多糖，而高浓度的盐胁迫则显著抑制S.javanicum胞外多糖分泌.

图3 NaCl浓度对伪枝藻胞外多糖分泌的影响

Fig. 3EffectsofconcentrationofNaClonEPSexudation

ofS.javanicum

2.3 pH值对爪哇伪枝藻分泌胞外多糖的影响

从图4中可见， pH值在偏中性7.5时，S.javanicum胞外多糖分泌量达到最大值(44.7 mg/L)，显著高于偏酸性(pH=5.5)和偏碱性(pH=11.5)处理下的胞外多糖分泌量(p<0.05)，而与BG-110基础培养下S.javanicum胞外多糖分泌量无显著性差异(p>0.05).

图4 pH值对伪枝藻胞外多糖分泌的影响

Fig.4EffectsofpHvalueonEPSexudationofS.javanicum

2.4 培养时间对爪哇伪枝藻分泌胞外多糖的影响

测定了培养5、15、30、45、60和90 d的S.javanicum培养液中的胞外多糖分泌量.图5显示，S.javanicum胞外多糖分泌量随时间逐渐增大，且与S.javanicum的生长时期密切相关.在对数生长期0～5 d的初始期内，S.javanicum开始缓慢分泌胞外多糖，当细胞进入对数期的中后期(10～15 d)时开始快速分泌胞外多糖.当S.javanicum进入稳定生长期(15～30 d)后，开始大量分泌胞外多糖到培养液中.在稳定生长期之后的很长时间内(30～90 d)，随着培养液中营养基质的耗尽和细胞的老化，S.javanicum胞外多糖又进入缓慢分泌期，而且这种胞外多糖缓慢地增长，可能还由于S.javanicum细胞裂解死亡后胞内多糖释放到培养液中的缘故.

图5培养时间对伪枝藻胞外多糖分泌的影响

Fig. 5EffectsofculturetimeontheEPSexudationof

S.javanicum

2.5 爪哇伪枝藻胞外多糖粗品分析

经旋转蒸发浓缩并经乙醇沉淀、丙酮洗涤、冷冻干燥后，得胞外多糖粗品为白色粉末，膨松、无嗅无味、易溶于水、略溶于低浓度乙醇.与硫酸-苯酚试剂反应呈砖红色.胞外多糖粗品提取产量可高达309.3 mg/L，其糖含量达70.42%(以葡萄糖为对照)，提取率为72.59%.

2.6 爪哇伪枝藻形态结构观察

采用光镜对温室条件下BG-110基础培养基培养的S.javanicum进行形态观察，并采用对25 ℃和35 ℃处理的S.javanicum进行超微结构观察.光镜下，S.javanicum藻丝体发达、纤细，见图6A(×4倍)，呈现假分支，即“伪枝”，藻细胞呈念珠状排列在共同的胶鞘中，见图6B(×10倍)；透射电镜下，35 ℃处理S.javanicum藻细胞形态结构保持完好，好于25 ℃处理的细胞形态，见图6C(25 ℃处理，×3500倍)和图6D(35 ℃处理，×1700倍).说明适度的高温有利于S.javanicum细胞形态结构的稳定.这与35 ℃处理下S.javanicum胞外多糖分泌量最大的测定结果相一致.

图6爪哇伪枝藻形态结构

Fig. 6MorphologicalstructuresofS.javanicum

3 讨论

与植物多糖相比，微藻多糖具有生产周期短安全性高，毒副作用小和理化特性独特等优点，已广泛应用于食品、医药、石油、化工和环保等多个领域.研究表明，蓝藻释放的EPS是复杂的杂聚物，约80%以上由6～10种不同的单糖组成[16].研究表明[17]，培养条件(如光照、营养、温度等)、生长阶段和培养年龄都对蓝藻向外分泌胞外多糖有影响.一些微生物胞外多糖在营养不平衡(如高的C、N比)和较低培养温度的条件下有利于其合成[18].本研究中发现，S.javanicum在较低温度(5 ℃和25 ℃)下不利于该藻胞外多糖的分泌，而在35 ℃高温下却能分泌更多的胞外多糖.吴沛沛等研究发现[18]，采用不同高温处理S.javanicum时，随温度升高，S.javanicum胞外多糖分泌量呈现出逐渐增大的趋势，即使在40 ℃的高温条件也能够分泌大量的胞外多糖，且S.javanicum最大光化学效率Fv/Fm和实际光化学效率ΦPSII在35 ℃下表现出最大值.S.javanicum在常温下培养骤然降至低温时，其胞外多糖的分泌量显著下降，而经过低温适应后再降至更低温度时，胞外多糖的分泌却出现了大幅度增加[19].本研究也发现，与较低温度(25 ℃)相比，35 ℃的高温更有利于S.javanicum细胞形态结构的保持和稳定，这也初步证实了S.javanicum能够适应35 ℃的高温条件并且生长良好，从而能在高温下分泌更多的胞外多糖.

当从低盐度(0.05 mol/L NaCl)增至较高盐度(0.2 mol/L NaCl)时，S.javanicum胞外多糖分泌量随盐度增加而显著增大(P<0.05),而在高盐度胁迫条件下(0.4 mol/L NaCl)则明显抑制了S.javanicum胞外多糖分泌.这说明盐度在一定浓度范围内有利于S.javanicum胞外多糖的分泌，而更高盐度则抑制了S.javanicum胞外多糖的合成.因此，S.javanicum胞外多糖的分泌存在最适盐度，类似的结果也出现在李朋富等人的研究中[20].本研究表明，pH值对S.javanicum分泌胞外多糖有一定的影响.在中性偏中性条件下(pH=7.5)，S.javanicum胞外多糖的分泌量明显高于其他pH下胞外多糖的分泌(P<0.05).可见，pH中性偏碱性时，利于该藻胞外多糖的合成.在对紫球藻的研究中发现，pH也能影响其胞外多糖的合成，当pH为偏中性时胞外多糖产量达到最大[21].

培养时间对S.javanicum胞外多糖分泌量有显著影响，其胞外多糖分泌量随培养时间的延长而增加，且在生长后期(静止期或稳定期)胞外多糖积累达到较高水平(图5).在对多种微藻合成胞外多糖的研究中也发现，微藻一般在对数生长期的后期和稳定期时它们的多糖产率最高[2].究其原因，主要是由于在培养早期，S.javanicum需要消耗细胞中的养分用于细胞营养生长，在生长中后期开始在藻细胞中合成多糖，并释放到培养基质中.因此，生长后期的胞外多糖分泌量明显高于生长前期.我们推测，微藻胞外多糖的分泌机制与生长周期可能存在密切关系，微藻在整个生长周期过程中都能不断地合成并释放胞外多糖，但在进入稳定期后分泌量增大.本文研究结果也验证了这一结论.一些学者对属于蓝藻胞外多糖的分离、纯化等进行了研究[22-23].值得指出的是，本研究直接采用离心、过滤去除S.javanicum细胞后的上清液进行浓缩，用于制备胞外粗多糖，并测定胞外多糖粗品中的糖含量，而没有考虑粗多糖中蛋白质、色素等其他因素的干扰，这可能对于实验测定结果造成一定的偏差.研究指出[24]，荒漠藻类胞外多糖对于保护藻细胞免受极端环境的胁迫中也起到重要作用，这些胞外多糖控制藻类细胞水分的吸收和输出，使细胞壁在吸涨和收缩过程中免受伤害.此外，藻类胞外多糖可能扮演着保护藻类自身和其他生物的角色，以抵抗低温、干旱、紫外线、抗生素或被原生动物吞食.

4 结论

适当的高温有利于S.javanicum细胞形态结构的稳定，表明S.javanicum有很好的高温耐受性，且适当的高温能够显著促进S.javanicum合成大量的胞外多糖.盐度在一定浓度范围内能够诱导S.javanicum胞外多糖的分泌，但高盐度胁迫抑制了S.javanicum胞外多糖的合成.pH中性偏碱性时，利于该藻胞外多糖的合成.生长周期对S.javanicum胞外多糖分泌量有显著影响，其胞外多糖分泌量随培养时间的延长而增加，且在生长后期(静止期或稳定期)胞外多糖积累达到较高水平.