中间型高温放线菌特异PCR快速鉴别方法的应用

张明娟 姚粟 李辉 刘洋 信春晖 许玲 程池

（1.中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015；2.山东扳倒井股份有限公司，高青 256300）

中间型高温放线菌（Thermoactinomyces intermedius）最早由Kurup于1981年发现，属于细菌域（Eubacteria）-厚壁菌门（Firmicutes）-芽孢杆菌纲（Bacilli）-芽孢杆菌目（Bacillales）-高温放线菌科（Thermoactinomycetaceae）-高温放线菌属（Thermoactinomyces），嗜高温，能产生丰富的菌丝和内生孢子［1，2]，常见于自然界的高温环境中。目前高温放线菌属中仅有3个有效种，即普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）、中间型高温放线菌（Thermoactinomyces intermedius）［2]和2013年发表的新种Thermoactinomyces daqus［3]，该属中的中间型高温放线菌具有生产耐热、光稳定的亮氨酸脱氢酶和苯丙氨酸脱氢酶的能力，这两个酶可以作为某些治癌药物合成的中间体，在制药工业上有重要的应用［4，5]。近年来，在芝麻香型白酒酿造微生物研究中发现中间型高温放线菌菌种为高温大曲中的优势菌种，其代谢产物对芝麻香型白酒特殊风味物质形成具有不可忽视的作用［6-8]，但目前尚无中间型高温放线菌与芝麻香型白酒风味物质形成的相关研究报道。故中间型高温放线菌在芝麻香型白酒酿造中作用还有待进一步研究。

因此，对高温大曲等高温环境中中间型高温放线菌菌株的筛选鉴别具有重要实践意义。然而，中间型高温放线菌与其近缘种之间在形态学特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列方面均十分接近，应用常规技术鉴别繁琐费时，无法满足中间型高温放线菌的筛选及其应用研究的要求，目前仍需建立一套准确、快速的中间型高温放线菌菌种鉴别方法，为其应用研究提供菌种资源。

gyrB基因即促旋酶（gyrase）的B亚单位基因，作为蛋白编码基因，其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，这就使得gyrB基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面，比非蛋白编码基因16S rDNA有更高的分辨率［9]。因此，本研究利用中间型高温放线菌gyrB序列，设计了中间型高温放线菌的种特异性PCR引物，建立了一套快速筛选中间型高温放线菌的特异PCR方法，并将其应用于芝麻香型白酒高温大曲中间型高温放线菌的筛选，以期可快速获得大量中间型高温放线菌菌株，旨为后续研究奠定菌种基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgarisDSM 43016T），普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgarisACCC 41061T），普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgarisZM60），甘蔗莱西氏菌（Laceyella sacchariDSM 43356T），恶臭莱西氏菌（Laceyella putidusDSM44608T），Thermoactinomyces daqusCICC 10681T，中间型高温放线菌（Thermoactinomyces intermediusDSM 43816T），地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisCICC 10101T），Laceyella tengchongensisCCTCC AA 208050T，Laceyella sediminisCCTCC AA 2011024T，芝麻香型白酒高温大曲中分离的25株高温细菌。

1.1.2 试剂TaqDNA聚合酶、dNTP、DL 2000 Marker、100 bp Marker购自天为时代生物有限公司；GoldView购自北京塞百盛基因技术有限公司；溶菌酶购自Sigma公司、蛋白酶K购自Merk公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen公司。

1.1.3 培养基 ISP2培养基：4 g/L葡萄糖，4 g/L酵母提取物，10 g/L麦芽提取物，固体培养基则添加20 g/L琼脂。NA培养基：蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，固体培养基则添加20 g/L琼脂。胰蛋白酶东酵母提取物：胰蛋白胨大豆肉汤30 g/L，酵母提取物3 g/L，固体培养基则添加20 g/L琼脂。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养T.vulgarisDSM 43016T，T.vulgarisACCC 41061T，L.sacchariDSM 43356T，L.putidusDSM44608T，L.tengchongensisCCTCC AA 208050T，L.sediminisCCTCC AA 2011024T，T.daqusCICC 10681T均用ISP2培养基55℃培养1 d；T.intermediusDSM 43816T用胰蛋白酶东酵母提取物培养基55℃培养1 d；B.licheniformisCICC 10101T用NA培养基37℃培养1 d；T.vulgarisZM60和25株芝麻香型白酒高温大曲中分离的高温细菌用NA培养基55℃培养1 d。

1.2.2 细菌DNA提取 利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取供试菌株的DNA，具体方法参见说明书。

1.2.3 特异PCR方法建立

1.2.3.1 引物设计 根据 GenBank数据库中中间型高温放线菌gyrB基因序列，设计了1对特异性引物，将引物用BLAST软件于互联网上进行比对，每条引物在本种内相同，种间具有差异，以此保证引物的种内通用、种间特异。引物序列见表1，引物由北京诺赛基因组研究中心合成。

表1 中间型高温放线菌特异引物序列

1.2.3.2 PCR反应体系和反应程序确定 以T.intermediusDSM 43816T的基因组DNA为模板，利用设计好的种特异性引物进行 PCR扩增。经过多轮条件优化后，建立适宜的PCR 反应体系和反应程序。

PCR 反应体系：10×Taqreaction buffer 5.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，10 μmol/L 的dNTP 4.0 μL，2.5 U的Taq酶0.6 μL，DNA模板1.0 μL，dd H2O 37.4 μL。

PCR反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃复性30 s，72℃延伸80 s，35个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3.3 引物特异性验证 以T. vulgarisDSM 43016T，T. vulgarisACCC 41061T，T. vulgarisZM60，L. sacchariDSM 43356T，L. putidusDSM44608T，T. daqusCICC 10681T，T. intermediusDSM 43816T，B. licheniformisCICC 10101T，L. tengchongensisCCTCC AA 2080-50T，L. sediminisCCTCC AA 2011024T的基因组DNA为模板，利用所设计的特异引物进行PCR扩增。PCR反应体系和程序见1.2.3.2。

1.2.4 芝麻香型白酒高温大曲中中间型高温放线菌筛选 以25株芝麻香型白酒高温大曲中分离的高温细菌为模板，利用所设计的特异引物进行扩增。PCR反应体系和程序见1.4.3.2。

2 结果

2.1 特异PCR方法建立

2.1.1 PCR反应体系和反应程序确定 以T.intermediusDSM 43816T的基因组DNA为模板，利用设计好的种特异性引物及优化后的PCR反应体系和反应程序进行 PCR扩增，扩增结果应用1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果（图1）显示，本研究所设计的引物和优化的PCR反应体系、反应程序可以从T.intermediusDSM 43816T的基因组DNA中扩增出576 bp的DNA片段。

图 1 PCR产物检测

2.1.2 引物特异性验证 以参考菌株的基因组DNA为模板，利用特异引物78F/618R进行PCR扩增，PCR反应体系和程序见1.2.3.2。扩增结果（图2）显示，仅有T. intermediusDSM 43816扩增出长约576 bp的清晰单一条带，与预期产物大小一致，其余9株细菌及阴性对照无单一条带。

因此，本试验设计的特异性引物78F/618R分别对物对中间型高温放线菌具有很好的种特异性，且所采用的PCR反应体系和反应程序适合进行中间型高温放线菌快速鉴别。

图 2 PCR产物检测

1.2.3 芝麻香型白酒高温大曲中中间型高温放线菌筛选 以25株芝麻香型白酒高温大曲中分离的高温细菌为模板，利用所设计的特异引物进行扩增。扩增结果（图3）显示：有HHH-8、HHH-10、HHH-13、HHH-15、HHH-20、HHH-2、QQ2、QQ3、QQ4、QQ5、QQ6，QQ7、QQ8、QQ9、ZQ18-4和H-7共16株菌扩增出长约576 bp的DNA片段，与预期产物大小一致，其余9株菌无条带，此次共获得16株中间型高温放线菌菌株。本试验仅经过DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳检测3个步骤，就可从高温细菌中筛选获得中间型高温放线菌菌株，节约了大量时间和成本。

3 讨论

目前微生物鉴别通常是将微生物的形态特征、生理生化特征、化学特征以及分子生物学特征进行有机整合，得出最终结论［10]，这一方法是目前细菌分类鉴定最准确可靠的方法。但是其实验通常繁琐耗时，对于菌株筛选大量并不适合，特异性PCR技术却为解决这一难题提供了捷径，特异PCR技术是目前快速准确鉴定菌种的方法之一，它是根据物种rDNA上可变区或编码基因的特有序列设计引物，进行物种鉴定的方法［11]。该方法因其简便快捷，已经广泛应用于菌株筛选鉴别、食品检测等各个研究领域，如本研究组刘勇等根据枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌基因组中β-甘露聚糖酶基因设计了3对种特异引物，通过特异PCR方法能够有效区分枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌［12]。商蓓等［13]根据苹果黑星病菌与其他苹果病原真菌核糖体基因转录间隔区序列间差异设计了1对特异性引物，用于苹果黑星病菌的分子检测，实现了苹果黑星病菌的快速检测。特异PCR方法在这些领域的应用使其在微生物鉴别、病原微生物检测方面可节约大量的时间和成本。本研究所建立的中间型高温放线菌特异PCR方法快速鉴别方法可从高温大曲中快速筛选出大量中间型高温放线菌菌种，与传统筛选鉴定方法相比，更加高效、廉价，十分有利于后期高温大曲中的中间型高温放线菌功能性研究，以及该菌种与芝麻香型白酒风味形成关系的研究。

图 3 25株高温细菌特异PCR产物检测

4 结论

本研究根据中间型高温放线菌gyrB基因设计的特异性引物具有较好的特异性，能快速高效实现中间型高温放线菌与其它近缘种的区分，所建立的特异PCR方法适合快速筛选出中间型高温放线菌菌种，与传统的筛选鉴定方法相比，具有高效、灵敏、便捷及成本低廉等显著优点。

［1] Yoon JH, Park YH. Phylogenetic analysis of the genusThermoactinomycesbased on 16S rDNA sequences［J] . International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, 50：1081-1086.

［2] Paul De Vos, Garrity GM, Jones D, et al. Bergey’s manual of systematic bacteriology second edition volume 3 ［M] . London：2009, 4：2574-2585.

［3] Yao S, Liu Y, Zhang MJ, et al.Thermoactinomyces daqussp. nov., a thermophilic bacterium isolated from high temperature Daqu［J] .International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2013 . doi：10.1099/ijs.0.055509-0.

［4] Muranova TA, Ruzheinikov SN, Sedelnikova SE, et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of substrate complexes of leucine dehydrogenase from thermoactinomyces intermedius［J] .Biological Crystallography, 2002, 58：1059-1062.

［5] Hanson RL, Howell JM, LaPorte TL, et al. Synthesis of allysine ethylene acetal using phenylalanine dehydrogenase fromThermoactinomyces intermedius［J] . Enzyme and Microbial Technology, 2000,26：348-358.

［6] 姚粟, 葛媛媛, 李辉, 等. 利用非培养技术研究芝麻香型白酒高温大曲的细菌群落多样性［J] . 食品发酵与工业, 2012, 38（6）：1-6.

［7] 刘洋, 赵婷, 姚粟, 等. 一株芝麻香型白酒高温大曲嗜热放线菌的分离与鉴定［J] . 生物技术通报, 2012（10）：210-216.

［8] 葛媛媛, 姚粟, 刘洋, 等. 芝麻香型白酒高温大曲嗜热细菌群落研究［J] . 食品发酵与工业, 2012, 38（11）：16-19.

［9] 安然, 易图永, 肖启明, 等.gyrB基因在细菌分类和检测中的应用［J] . 江西农业学报 2010, 22（4）：18-20.

［10] 沈萍. 微生物学［M] . 北京：高等教育出版社, 2006：314-317.

［11] 赵潞, 张列兵, 张世湘, 等. 利用种特异性PCR快速鉴定新疆酸马奶优势菌群［J] . 中国乳品工业, 2010, 38（1）：12-14.

［12] 刘勇, 李辉, 李金霞, 等. 特异PCR方法对枯草芽孢杆菌群的鉴定区分［J] . 饲料工业, 2010, 31（4）：52-54.

［13] 商蓓, 付洁, 罗泽青, 等. 苹果黑星病菌的分子检测［J] . 西北农林科技大学学报, 2010, 38（8）：104-110.