中链甘油三酯对高胆固醇血症小鼠胆固醇逆转运的影响

张新胜，刘 钊，王 觐，张 永，刘英华，徐 庆，于晓明，杨雪艳，薛长勇

解放军总医院 营养科，北京 100853

基础研究

中链甘油三酯对高胆固醇血症小鼠胆固醇逆转运的影响

张新胜，刘 钊，王 觐，张 永，刘英华，徐 庆，于晓明，杨雪艳，薛长勇

解放军总医院 营养科，北京 100853

目的观察中链甘油三酯(medium-chain triglyceride，MCT)对高胆固醇血症小鼠体质量、体脂、血清脂质水平及其体内胆固醇逆转运的影响。方法建立高胆固醇血症小鼠模型，将30只造模成功小鼠随机分为中链甘油三酯组(MCT组)和长链甘油三酯(long-chain triglyceride，LCT)组，给予含2% MCT和2% LCT高脂高胆固醇饲料喂养3个月后，腹腔注射富含3H胆固醇的RAW264.7巨噬细胞悬液，单笼饲养3 d，收集每天粪便，腹主动脉取血，测量体长、肝及附睾脂肪组织。测定血清脂质，用液闪计数仪测定血清、肝及粪便中3H胆固醇放射活性。结果实验结束时，与LCT组相比，MCT组小鼠空腹体质量、体质量增加量、Lee氏指数、附睾脂肪重量及血清TC水平显著降低(P＜0.05)；两组血清HDL-C、n-HDL-C和TG差异无统计学意义(P＞0.05)；与LCT组比较，MCT组血清和肝3H胆固醇水平均显著降低(P＜0.05)，同时48 h粪便中3H胆固醇流出量及72 h总量显著增加(P＜0.05)。结论MCT能够减轻高胆固醇血症小鼠体质量，减少体脂肪积累和改善胆固醇代谢，且能促进体内胆固醇的逆转运。

胆固醇逆转运；中链甘油三酯；长链甘油三酯；3H-胆固醇

胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport，RCT)是机体将外周巨噬细胞胆固醇通过高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)介导转运至肝，再通过胆汁排泄到体外的过程。目前，认为RCT是对抗动脉粥样硬化(artherosclerosis，As)发生的主要机制之一，因此，RCT也成为对抗AS新的研究靶点[1]。众所周知膳食因素与心血管疾病的发生有关，特别是膳食脂肪酸与AS的发生和发展密切相关。有研究报道，饱和脂肪酸增加血清低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平，促进AS的发生[2]。而不饱和脂肪酸能够保护心血管疾病，对抗AS的发生和发展，如ω-3脂肪酸(DHA和EPA)[3]。但并不是所有的饱和脂肪酸对心血管疾病都有害。中链脂肪酸(medium chain fatty acids，MCFA)为一种特殊的饱和脂肪酸，常见的有辛酸(C8∶0)和癸酸(C10∶0)，主要来源于母乳、牛奶及其制品、棕榈仁油和椰子油等。我们前期的研究发现含有MCFA的中链甘油三酯(medium-chain triglyceride，MCT)能够改善高甘油三酯血症患者及肥胖C57BL/6J小鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平，减少体脂肪蓄积，还能促进粪便的胆固醇和胆汁酸的排泄[4-6]。本研究以高胆固醇血症小鼠模型为研究对象，观察MCT对该小鼠体质量、体脂、血清脂质水平及其体内胆固醇逆转运的影响，进一步探讨MCT在防治AS发生及发展中的作用。

材料和方法

1 细胞及材料 RAW264.7巨噬细胞株由北京协和医科大学细胞库提供；DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司；3H-胆固醇购自Perkin Elmer公司；氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)购自中国科学院协和生化研究所；中链甘油三酯和大豆油由日清奥利友(中国)投资有限公司提供，脂肪酸组成见文献[7]。

2 C57BL/6J高胆固醇血症小鼠模型的建立 70只雄性C57BL/6J小鼠(10周龄)，由中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证号SCXK京2009-0007。普通饲料适应喂养1周后，按空腹体质量随机选择10只喂饲普通饲料AIN-96G(ND组)，余60只喂饲高脂高胆固醇饲料(HFC组)，4周后称量空腹体质量，颌下静脉采血检测血清胆固醇，选择体质量及血清胆固醇均高于普通饲料组小鼠2倍标准差的个体，即造模成功。

3 小鼠分组及干预 选取造模成功的C57BL/6J高胆固醇血症小鼠30只，按照血清胆固醇和体质量随机分为2组，每组15只，分别喂给高脂高胆固醇饲料+ 2% LCT(LCT组)、高脂高胆固醇饲料+ 2% MCT(MCT组)，饲料配方见表1。喂养12周后，每只小鼠腹腔注射制备好的富含3H胆固醇的巨噬细胞混悬液0.5 ml，之后单笼饲养3 d，分别收集每天粪便。第3天用1%的硫喷妥钠0.1 ml腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，1 200 r/min离心5 min，取20 μl血清直接进行液闪计数，计算血清占注射总量的百分比。

4 细胞培养及干预 RAW264.7巨噬细胞培养条件：37℃，5% CO2，100%湿度培养箱，含10%胎牛血清的DMEM培养基。同位素标记细胞混悬液制备：取15 ml离心管加入终浓度为50 mg/L ox-LDL，再加入3H-胆固醇(干预浓度5 mCi/L)，37℃孵育30 min，最后加入DMEM培养基混匀，将制备好的干预液细胞培养瓶置于37℃培养箱培育48 h。加入胰酶使贴壁细胞脱落和分散，DMEM冲洗2遍，用不含胎牛血清的DMEM培养液将调整细胞数为10×106/ml后，细胞悬液转移至1 ml注射器(置于冰上)，剩余的细胞悬液分别测定细胞及上清液中的放射活性，保证细胞放射活性所占比例＞95%。

表1 饲料成分表Tab. 1 Composition of feed for different groups (%)

5 小鼠体质量、体脂测量及血脂检测 饲养期间每4周测1次空腹体质量(禁食不禁水12 h)，同时每隔1 d更换垫料和水，称量饲料消耗量。实验结束后，测量体质量、体长，分离肝及附睾脂肪组织并用万分之一天平称量。用酶法测定血清血脂包括TC、TG、HDL-C及n-HDL-C。

6 粪便的处理及放射活性测定 小鼠腹腔注射富含3H胆固醇的巨噬细胞混悬液后，分别测量第1、2、3天小鼠粪便胆固醇放射活性，并计算3 d总放射活性占注射总量的百分比。粪便的处理：用镊子拣取小鼠粪便并称重，将粪便转移至组织匀浆器中，加入50%乙醇溶解粪便使浓度为0.114 kg/L，充分混匀1 ～ 2 min，取50 μl混匀液至2 ml液体闪烁液，振荡混匀，过夜。第2天再振荡液闪瓶，并进行液闪计数，计算粪便总放射活性及占注射总量的百分比。

7 肝脂质抽提及放射活性测定 准确称取部分冷冻组织(约100 mg)放入玻璃匀浆器，加入正己烷/异丙醇(3∶2)，充分混匀10 min，1 200 r/min离心5 min，收集上清液，再重复抽提2遍，真空干燥，将干燥脂质溶于2 ml闪烁液，充分振摇混匀即可进行液闪计数，计算肝总放射活性及占注射总量的百分比。

8 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件处理数据，数据均采用以±s表示。采用t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 C57BL/6J肥胖合并高胆固醇血症小鼠模型的建立 HFC组和ND组小鼠分别给予高脂高胆固醇饲料和基础饲料喂养4周后，HFC组和ND组小鼠平均体质量分别为(24.37±1.29) g和(22.39±0.66) g；HFC组和ND组小鼠血清总胆固醇水平分别为(3.6±0.38) mmol/L和(2.62±0.23) mmol/L。C57BL/ 6J高胆固醇血症小鼠动物模型成功率达63%左右。

2 饲料摄入量情况 MCT组与LCT组比较，实验期第4周、8周、12周饲料摄入量、饲料平均摄入量和能量平均摄入量差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

3 两组小鼠体质量及体脂变化 MCT组与LCT组比较，于0周、4周、8周空腹体质量差异无统计学意义(P＞0.05)；但12周时MCT组空腹体质量、实验期间体质量增加量、Lee氏指数以及附睾脂肪重量均低于LCT组(P＜0.05)。见表3。

表2 两组小鼠饲料摄入量Tab. 2 Feed consumption during the experiment

表3 MCT对小鼠体质量、体脂、肝重及Lee氏指数的影响Tab. 3 Effect of MCT on body weight, body fat, liver weight and Lee's index

4 两组小鼠血脂比较 实验结束后MCT组血清TC水平明显低于LCT组(P＜0.05)，但两组血清HDL-C、n-HDL-C和TG差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

5 肝、粪便、血清中3H-胆固醇的分布 实验结束后，MCT组小鼠血清和肝3H胆固醇水平均明显低于LCT组(P＜0.05)。此外，MCT组于注射3H胆固醇后48 h粪便中胆固醇流出量及72 h合计的胆固醇流出量均高于后者(P＜0.05)。见表5。

表4 两组小鼠血脂比较Tab. 4 Effects of MCT and LCT on blood lipid and lipoprotein

表5 两组小鼠体内3H胆固醇分布比较Tab. 53H cholesterol distribution after intraperitoneal injection of RAW264.7 macrophages with labeling of3H cholesterol in various groups

讨 论

RCT是排除机体过多胆固醇的有效途径之一，也是对抗AS形成的重要机制。早在1973年Glomset和Norum[8]就提出了这一概念，但没有适当的方法检测胆固醇逆转运效率。本文参考Zhang等[9]的方法给小鼠腹腔注射富含3H胆固醇的巨噬细胞后，通过检测血清、肝及粪便中3H胆固醇的放射活性来反映胆固醇的逆转运效率。本方法3H放射能量低，对实验操作者损害较小，而且检测胆固醇逆转运准确性和可靠性较高。

本研究成功建立了高胆固醇血症小鼠模型，再给予富含MCT和LCT的饲料干预后，MCT组小鼠空腹体质量、实验期间体质量增加量、Lee氏指数以及附睾脂肪重量均低于LCT组小鼠，并且血清胆固醇水平也显著下降，这与我们前期研究的结果一致[10]。腹腔注射富含3H胆固醇的细胞混悬液后，MCT组小鼠血清和肝3H胆固醇水平均明显低于LCT组。此外，MCT组小鼠粪便中胆固醇流出量明显高于后者。这也说明了MCT较LCT明显促进肥胖合并高胆固醇血症小鼠体内胆固醇逆转运，能够防治AS的发生和发展。人们一直认为饱和脂肪酸能够提高血清LDL-C水平、促进AS的形成，而不饱和脂肪酸却能够降低AS的发生。有研究报道，亚油酸能够降低血清胆固醇水平而降低AS的发生，鱼油能够增强肝排出巨噬细胞及HDL来源的胆固醇而促进RCT[2,11]。本实验同样发现MCT能够促进RCT，促进粪便胆固醇的排出，对AS具有一定保护作用。

RCT是一个复杂的转运过程，主要包括胆固醇的流出、酯化和清除3个环节，并且受到多种酶及受体的调节。其中ATP结合盒转运体超家族(ABCA1、ABCG1)及清道夫受体B族(SR-B1)介导了细胞胆固醇的流出，流出的胆固醇在卵磷脂胆固醇酰基转移酶的催化下胆固醇酯化，使新生的HDL转变为成熟的HDL，肝表面SR-BI受体接受HDL中的胆固醇，主要在ABCG5及ABCG8的调控下促进合成胆汁酸，大部分进入肝肠循环，小部分随着粪便排出体外。Marmillot等[12]报道鱼油能够增强HDL的运载能力而促进胆固醇的流出，亚麻酸能够抑制固醇酰辅酶A脱氢酶1而降低胆固醇在泡沫细胞内的聚集[13]。也有研究报道称虽然多不饱和脂肪酸能够影响胆固醇的内平衡，但它们并不能改变ABCA1及肝X受体α基因的表达，也许和其他蛋白或基因表达相关[14]。关于MCT是如何促进RCT过程，我们研究小组细胞实验发现中链脂肪酸C8∶0能够促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇的流出(结果尚未发表)，MCT是否能够调节RCT的相关蛋白或基因的表达，还需要进一步的探讨。另外，MCT是否能够影响AS的形成和发展还需要动物及临床试验进一步验证。

总之，众多基础和临床研究已经证实MCT能够降低体质量、减少体脂及改善血脂代谢。本研究也证实了MCT能够改善高胆固醇血症小鼠体质量、体脂肪和血清胆固醇水平，而且能够促进其体内胆固醇逆转运，降低AS的发生。

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4 徐庆，刘英华，王觐，等.中长链脂肪酸食用油对高甘油三酯血症患者脂代谢的影响［J］.军医进修学院学报，2009，30（4）：511-513.

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8 Glomset JA， Norum KR. The metabolic role of lecithin： cholesterol acyltransferase： perspectives form pathology［J］. Adv Lipid Res，1973， 11： 1-65.

9 Zhang Y， Da Silva JR， Reilly M， et al. Hepatic expression of scavenger receptor class B type I （SR-BI） is a positive regulator of macrophage reverse cholesterol transport in vivo［J］. J Clin Invest，2005， 115（10）： 2870-2874.

10 刘英华，张永，于晓明，等.中链脂肪酸改善高脂饲料短期和长期喂养C57BL/6J小鼠的脂蛋白水平的作用［J］.实用预防医学，2011，18（9）：1610-1613.

11 Nishimoto T， Pellizzon MA， Aihara M， et al. Fish oil promotes macrophage reverse cholesterol transport in mice［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2009， 29（10）： 1502-1508.

12 Marmillot P， Rao MN， Liu QH， et al. Effect of dietary omega-3 fatty acids and chronic ethanol consumption on reverse cholesterol transport in rats［J］. Metabolism， 2000， 49（4）： 508-512.

13 Zhang J， Kris-Etherton PM， Thompson JT， et al. Alpha-linolenic acid increases cholesterol efflux in macrophage-derived foam cells by decreasing stearoyl CoA desaturase 1 expression： evidence for a farnesoid-X-receptor mechanism of action［J］. J Nutr Biochem，2012， 23（4）： 400-409.

14 Salehipour M， Javadi E， Reza JZ， et al. Polyunsaturated fatty acids and modulation of cholesterol homeostasis in THP-1 macrophagederived foam cells［J］. Int J Mol Sci， 2010， 11（11）： 4660-4672.

Effects of medium-chain triglyceride on reverse cholesterol transport in mice with hypercholesterolemia

ZHANG Xin-sheng, LIU Zhao, WANG Jin, ZHANG Yong, LIU Ying-hua, XU Qing, YU Xiao-ming, YANG Xue-yan, XUE Changyong
Department of Nutrition, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

XUE Chang-yong. Email: cnxcy@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of medium-chain triglyceride (MCT) on reverse cholesterol transport in mice with hypercholesterolemia.MethodsThirty mice with hypercholesterolemia induced by feeding high-fat and cholesterol were randomly divided into 2 groups (MCT group and LCT group, n=15), and they were fed high-fat and cholesterol diets with 2% MCT or 2% long-chain triglyceride (LCT), respectively. Three months later, macrophage reverse cholesterol transport (RCT) was assessed by injecting3H-cholesterol labeled RAW264.7 macrophages intraperitoneally. After 3 days, feces were collected and the body length, liver and epididymides tissues were measured. The serum lipid was measured and the activity of3H-tracer in serum, liver and feces were determined by liquid scintillation method.ResultsAt the end of study, the body weight, weight gain, liver weight, Lee's index, epididymides fat weight and serum levels of TC were significantly lower in MCT group than those in LCT group (P＜0.05), while no significant difference showed in serum levels of HDL-C, n-HDL-C and TG between the two groups (P＞0.05). Compared with the LCT group, the3H-cholesterol in serum and liver were much lower in MCT group (P＜0.05), while the total3H-cholesterols in feces in 3 days experiment and at 48h after the injection of3H-cholesterol labeled RAW264.7 macrophages increased significantly (P＜0.05).ConclusionMCT can reduce the body weight and body fat, and it also can improve cholesterol metabolism and promote RCT in mice with hypercholesterolemia.

reverse cholesterol transport; medium-chain triglyceride; long-chain triglyceride;3H-cholesterol

R 589.2

A

2095-5227(2014)11-1133-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.015网络出版时间：2014-09-18 09:50 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140918.0950.002.html

2014-05-14

国家自然科学基金项目(81172667)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(8117 2667)

张新胜，男，在读硕士，主治医师。Email: zhangxin sheng198431@126.com

薛长勇，男，硕士，主任医师，硕士生导师，主任。Email: cnxcy@163.com