MicroRNA 122促进吉西他滨对体外非小细胞肺癌细胞系A549的杀伤作用

马德宾，冯 帆，张 帆，杨俊兰，史国兵，韩雅玲，张志远沈阳军区总医院，辽宁沈阳 006；解放军总医院 肿瘤内科，北京 00853

MicroRNA 122促进吉西他滨对体外非小细胞肺癌细胞系A549的杀伤作用

马德宾1，冯 帆1，张 帆2，杨俊兰2，史国兵1，韩雅玲1，张志远1
1沈阳军区总医院，辽宁沈阳 110016；2解放军总医院 肿瘤内科，北京 100853

目的探讨microRNA 122(miRNA122)对细胞毒性化疗药吉西他滨对体外杀伤非小细胞肺癌细胞株的影响。方法利用脂质体转染miRNA122的表达载体；CCK-8测定系列浓度梯度吉西他滨检测对非小细胞肺癌细胞株A549的抑制率，计算IC50值；平板克隆实验检测吉西他滨对A549细胞杀伤的影响；流式细胞仪-Annexin/PI双染实验检测吉西他滨诱导A549细胞凋亡率。结果吉西他滨对A549细胞具有明显地体外杀伤作用，其IC50值为(78.65±5.25)nmol/L，转染miRNA122能够上调吉西他滨的活性，其IC50值为(10.26±1.18)nmol/L；流式细胞术结果显示：A549细胞凋亡率诱导转染空载体组为26.24%±1.94%，诱导转染miRNA122组为63.30%±3.96%。miRNA122能够显著上调吉西他滨诱导A549细胞凋亡率。RT-PCR和蛋白印迹实验表明，转染miRNA122能够显著上调A549细胞内miRNA122的表达水平，降低miRNA122靶基因和调控基因的表达水平。结论miRNA122能够上调吉西他滨对非小细胞肺癌细胞系A549的体外杀伤作用。

微小RNA122；非小细胞肺癌；吉西他滨；

MicroRNAs在真核生物系统发育以及细胞增殖调控等生理过程中发挥了重要作用，作为特殊的调节因子，miRNA也能够参与调控多种肿瘤的发生。miRNA122最早被发现与丙型肝炎病毒相关，能够在肝癌细胞增殖调控发挥作用[1-2]。最近的研究显示， miRNA122有可能参与肺癌细胞株的增殖[3]。吉西他滨是一种核糖核苷酸还原酶抑制剂，能够通过阻断DNA合成和修复抑制肿瘤细胞增殖，阻断其周期运转[4]。本研究利用非小细胞肺癌细胞株A549，观察miRNA122对吉西他滨体外抗肿瘤活性的影响。

材料和方法

1 药品和试剂 吉西他滨购自大连美仑生物技术有限公司，由质谱确认其结构正确，采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)检测其纯度＞98%，使用DMSO配制成3 mmol/L的母液，4℃保存；miRNA122由上海捷瑞公司化学合成；DMEM高糖培养基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Hyclone公司；CCK-8试剂购自美国Amerresco公司；双染法细胞凋亡试剂盒(包含Annexin V Binding Buffer、FITCAnnexinV以及7-AAD Viability Staining Solution)购自Biolegend公司；CCK-8试剂盒和Lipofectamine-RNAi MAX转染试剂购自Invitrogen公司；RTPCR试剂盒购自美国Promega公司；蛋白印迹实验(Western blot)检测试剂盒(包括SDS-蛋白电泳Loading Buffer、蛋白Marker，以及硝酸纤维素膜)购自美国Bio-Rad公司；蛋白印迹实验所用抗体均购自Santa Cruz公司；化学发光试剂盒(北京Qiangen公司)；其余试剂均为国产分析纯试剂。细胞培养瓶(Corning 430641)以及24孔细胞培养板(Corning 3337)购自美国Corning公司。

2 主要设备 多功能酶标仪(Wallac公司)；TS-100倒置相差显微镜购自日本Nikon公司。

3 细胞培养和转染 非小细胞肺癌细胞株A549购自中国医学科学院中国协和医科大学细胞库，培养于含2 mmol/L的L-谷氨酰胺和10% FBS的高糖DMEM培养液中；置37℃，5% CO2孵箱中培养。先分别将0.5μl的Lipofectamine-RNAi MAX转染试剂和200 ng质粒(由0.5μl无血清无抗生素的RPMI-1640培养基溶解与稀释)加入到2管(含24.5μl无血清无抗生素培养基)中，混匀，室温静置15 min后，将两管液体等比例混合，混匀后室温静置15 min。

4 细胞抑制率实验 将非小细胞肺癌细胞株A549细胞接种于24孔板中，待每空细胞密度达到80% ～90%时换新鲜培养基，每孔1 ml；配置系列浓度梯度的吉西他滨工作液(0.000 3 mmol/L、0.001 mmol/L、0.003 mmol/L、0.01 mmol/L、0.03 mmol/L、0.1 mmol/L以及0.3 mmol/L)，按照1∶1 000的比例加入24孔板中(每孔1 μl)，使吉西他滨的终浓度为：0.000 3μmol/L、0.001μmol/L、0.003μmol/L、0.01μmol/L、0.03μmol/L、0.1μmol/L以及0.3μmol/L；药物处理A549细胞48 h后，每孔加入30μl CCK-8试剂，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育4 h后，多功能酶标仪在450 nm测定吸光度，并计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(对照组A 450 nm-药物处理组A 450 nm)/(对照组A 450 nm-溶剂对照组A 450 nm) ×100%。

5 平板克隆实验 对数生长期的非小细胞肺癌细胞株A549加入IC50浓度的吉西他滨处理48 h后，制备细胞悬液，以200个细胞/皿的密度种于9 cm直径培养皿中，置37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养10 ～ 15 d。当克隆肉眼可见时，终止培养。用无水乙醇固定过夜，加适量结晶紫染液染色10 ～ 30 mins，洗去染色液，空气干燥。

6 凋亡实验 实验步骤参考文献[5]，对数生长期的非小细胞肺癌细胞株A549加入IC50浓度的吉西他滨处理48 h后，消化并离心(800 r/m)，使用PBS洗3次，使用100μl Annexin V Binding Buffer重悬，加入FITC-AnnexinV和7-AAD各5μl，室温避光染色15 min，再用500μl Annexin V Binding Buffer重悬于流式管中，上机检测。

7 反转录实验 基本按照文献[6-9]描述的方法，A549细胞转染核酸后，收集细胞，提取RNA，反转录，DNA电泳检测。

8 蛋白免疫印迹实验 基本按照冯帆等[10]的方法进行实验，一抗稀释条件：兔抗人CycinG1单抗(1∶2 000稀释)，兔抗人IGF1R单抗(1∶1 000稀释)，鼠抗人CycinB1多抗(1∶1 000稀释)，鼠抗人P-GP多抗(1∶500稀释)，兔抗人GAPDH多抗(1∶5 000稀释)；二抗稀释条件：HRP-羊抗兔单克隆抗体(1∶5 000稀释)，HRP-羊抗鼠单克隆抗体(1∶5 000稀释)。

9 统计学分析 应用SPSS17.0统计软件，采用单因素方差分析比较多组件的±s，P＜0.05为差异有统计学意义；使用统计和绘图软件Origin 6.1中的Sigmoidal Fit模块进行回归分析，拟合量药物作用的效曲线并计算相应IC50值；使用Polymoidal Fit模块计算药物作用曲线的R2值和P值。

结 果

1 miRNA122对吉西他滨抑制A549细胞的影响利用Origin 6.1软件绘制吉西他滨对A549细胞的剂量-抑制率曲线(图1)。结果显示，吉西他滨能够剂量依赖性地杀伤A549细胞(图1A)，其IC50值为(78.65±5.25) nmol/L，R2值和P值分别为0.94和0.005 8；转染miRNA122的A549细胞对吉西他滨的敏感性明显上调(图1B)，其IC50值为(10.26± 1.18) nmol/L，R2值和P值分别为0.96和0.003 6。

2 miRNA122上调吉西他滨对A549细胞克隆形成的抑制作用 检测miRNA122对吉西他滨抑制A549细胞克隆形成的影响(图2)。结果显示，与溶剂对照相比(图2A)，IC50浓度(80 nmol/L)的吉西他滨能够显著抑制A549细胞的克隆形成能力(图2B)；转染miRNA122能够显著促进吉西他滨对A549细胞克隆形成的抑制作用(图2C)。

3 miRNA122促进吉西他滨诱导A549细胞凋亡检测miRNA122对吉西他滨诱导A549细胞凋亡的影响(图3)。结果显示，与溶剂对照相比(图3A)，IC50浓度(80 nmol/L)的吉西他滨能够显著诱导A549细胞凋亡(图3B)；转染miRNA122能够显著促进吉西他滨诱导的A549细胞凋亡(图3C)。吉西他滨诱导溶剂对照组细胞凋亡率(图3D)为6.24%±0.32%；诱导转染空载体组A549细胞凋亡率为26.24%±1.94%；诱导转染miRNA122组A549细胞凋亡率为63.30%±3.96%。进一步的RT-PCR和蛋白印迹实验结果证实了miRNA122的转染效率，与对照相比，转染miRNA122的A549细胞中，miRNA122的表达水平明显上调(图4A)，miRNA122能够显著下调其作用靶基因CyclinG1和IGF1R的蛋白水平(图4B)，并能够下调其相关蛋白CyclinB1和P-GP的表达(图4C)。

讨 论

DNA是重要生物大分子，也是重要的药物作用靶标，依托泊苷、氮芥、丝裂霉素C、米托蒽醌等、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、阿霉素、表柔比星、顺铂等细胞毒性化疗药物，能够通过多种机制造成DNA损伤，抑制肿瘤细胞存活、增殖与周期运转[11-15]。与分子靶向药物相比，上述细胞毒性药物有作用浓度低、不易出现耐受等优点。作为一种新型细胞毒性抗肿瘤药物，吉西他滨一方面能够作为核苷酸的类似物掺入DNA中，造成DNA损伤，阻断DNA复制与修复，诱导细胞凋亡；另一方面，能够作为核糖核苷酸还原酶抑制剂，通过抑制核苷酸合成阻断DNA复制与修复，诱导细胞凋亡[16-17]。作为重要的miRNA，miRNA122一直被认为是肝炎，以及肝癌的重要调节因子，但近年来也发现其在肺癌中也具有重要功能[1-2]。Ma等[3]报道，利用腺病毒在非小细胞肺癌细胞中表达miRNA122，能够阻滞细胞增殖，诱导细胞凋亡。我们的结果显示，吉西他滨对A549细胞具有明显地体外杀伤作用，其IC50值为(78.65±5.25) nmol/L，转染miRNA122能够上调吉西他滨的活性，其IC50值为(10.26±1.18) nmol/L；流式细胞术结果显示：吉西他滨诱导溶剂对照组细胞凋亡率(图3D)为6.24%±0.32%；诱导转染空载体组A549细胞凋亡率为26.24%±1.94%；诱导转染miRNA122组 A549细胞凋亡率为63.30%±3.96%。

图 1 miRNA122对吉西他滨杀伤A549细胞的影响A： A549细胞转染空对照； B： A549细胞转染miRNA122Fig. 1 Effect of miRNA122 on Gemcitabine activity in A549 cells A: A549 cells transfected with control; B: A549 cells transfected with miRNA122

图 2 miRNA122对吉西他滨抑制A549细胞克隆形成的影响A： DMSO + A549细胞转染空对照； B：Gemcitabine + A549细胞转染空对照； C： Gemcitabine + A549细胞转染miRNA122 Fig 2 Effect of miRNA122 on Gemcitabine activity in colony formation of A549 cellsA: A549 cells which transfected with control were treated with DMSO; B: A549 cells which transfected with control were treated with Gemcitabine; C: Gemcitabine + A549 cells transfected with miRNA122 vectors

图 3 miRNA122对吉西他滨诱导A549细胞凋亡的影响 A： DMSO + A549细胞转染空对照； B： Gemcitabine + A549细胞转染空对照； C： Gemcitabine + A549细胞转染miRNA122； D：各实验组的凋亡率(aP=0.012，bP=0.004 4，cP=0.009 5)Fig. 3 Effect of miRNA122 on Gemcitabine activity in apoptosis of A549 cells A: A549 cells which transfected with control were treated with DMSO; B: A549 cells which transfected with control were treated with Gemcitabine; C: Gemcitabine + A549 cells transfected with miRNA122 vectors; D: Apoptosis rates of groups(aP=0.012，bP=0.004 4，cP=0.009 5)

图 4 miRNA122等的转染效率 A ～ C： A549细胞分别转染对照或miRNA122； A： RT-PCR实验检测miRNA122的表达水平； B： 蛋白印迹实验检测A549细胞中miRNA122的作用靶标蛋白CyclinG1和IGFR的表达量； C： 蛋白印迹实验检测A549细胞中miRNA122调控基因CyclinB1和P-GP的表达量Fig. 4 Transfection of miRNA12 in A549 cells A-C: A549 cells which were transfected with control or miRNA122, was analyzed by WB assays. The expression level of miRNA122 was determined by RT-PCR assays (A). The expression of microRNA122 targeted genes CyclinG1 or IGFR (B), and the expression of CyclinB1 or MDR-1 (P-GP) was detected via anti-bodies (C). The β-Actin or GAPDH was used as the loading control

文献报道miRNA122能够降低多药耐药基因MDR(Multi-drug resistance，MDR)以及AKT、BCL-2等的表达[7,18]。为此我们进行了A549细胞转染miRNA122后进行WB实验，与对照组相比，miRNA122能够显著下调其作用靶基因周期素G1和胰岛素样生长因子1受体的蛋白水平，同时也能够下调周期素B1以及多药耐药基因编码的P-糖蛋白的表达。周期素与细胞分裂和周期运转密切相关；IGF1R作为重要的受体酪氨酸蛋白激酶能够诱导细胞增殖与侵袭；P-糖蛋白是肿瘤细胞化疗药物耐受的调控枢纽。上述结果表明，本研究转染效率高，细胞模型有效，miRMA122有可能通过下调上述蛋白因子的表达发挥化疗药增敏的作用。我们拟在进一步实验中检测miRNA122是否在A549细胞中影响细胞存活与凋亡抑制基因Survivin和抑制蛋白IAP的表达，并进一步分析其促进吉西他滨诱导细胞凋亡的机制。

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MicroRNA122 enhances the cytotoxic activity of Gemcitabine on A549 cells

MA De-bin1, FENG Fan1, ZHANG Fan2, YANG Jun-lan2, SHI Guo-bing1, HAN Ya-ling1, ZHANG Zhi-yuan1
1General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China;2Department of Medical Oncology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

s: HAN Ya-ling. Email: hanyaling@263.net; ZHANG Zhi-yuan. Email: yuan@live.cn

ObjectiveTo investigate the effect of microRNA122 (miRNA122) on cytotoxic activity of Gemcitabine on A549 cells.MethodsThe expression vector of miRNA122 was transfected using liposomes, and the CCK-8 was used to test the inhibition rate of Gemcitabine on non-small cell lung cancer A549 cells, then the score of IC50was calculated. The effect of Gemcitabine on non-small cell lung cancer A549 cells was tested by colony-forming assay, and the apoptosis rate of A549 cells induced by Gemcitabine was tested by flow cytometry-Annexin/PI experiment.ResultsTransfection of miRNA122 enhanced the cytotoxic activity of Gemcitabine on A549 cells with the IC50values reducing from (78.6±5.25) nmol/L to (10.26±1.18) nmol/L. Moreover, transfection of miRNA122 up-regulated the apoptosis of A549 cells induced by Gemcitabine with the apoptosis rates increasing from 26.24%±1.94% to 63.30%±3.96%. The results of RT-PCR and Western Blot assays showed that the expression level of miRNA122 was up-regulated, and its targeted genes were down-regulated via transfected miRNA122.ConclusionmiRNA 122 can enhance the cytotoxic activity of Gemcitabine on A549 cells.

microRNA122; non-small-cell lung carcinoma; Gemcitabine

R 73-3

A

2095-5227(2014)11-1160-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.021

时间：2014-08-29 17:12 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140829.1712.003.html

2014-07-21

全军医学科研“十二五”项目(BWS12J007)；国家科技重大专项“重大新药创制”项目(2012ZX09303016-002)；“辽宁省第一批次科学技术计划”项目(2011225008)

Supported by the Military Special-purpose Program of "Twelfth Five-Year" (BWS12J007); “Major Country to Create a Special New Drugs”S&T Major Project(2012ZX09303016-002); The First Batch of Liaoning Science and Technology Project(2011225008)

马德宾，男，博士，主治医师。研究方向：肿瘤学。Email: madebin119@163.com；

韩雅玲，女，博士，中国工程院院士，主任医师，博士生导师，副院长。Email: hanyaling@263.net；张志远，男，博士，主治医师。Email: yuan@live.cn