原发性高血压患者血清脂联素及其基因多态性与冠心病的相关性研究

李 杨秦 勤△ 任 蓓赵丽丽毛用敏郑 萍

原发性高血压患者血清脂联素及其基因多态性与冠心病的相关性研究

李 杨1秦 勤1△任 蓓1赵丽丽1毛用敏2郑 萍1

目的 探讨原发性高血压患者血清脂联素水平及其基因单核苷酸多态性（SNP）rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262与冠心病及冠脉病变程度的关系。方法以高血压患者414例（其中单纯高血压患者180例，高血压合并冠心病患者234例）和正常对照组185例为研究对象，应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清脂联素水平，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法检测脂联素rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262位点多态性。结果高血压合并冠心病组脂联素水平较对照组和单纯高血压组显著降低。脂联素rs7649121位点杂合子AT基因型较AA基因型可降低冠心病风险（校正OR=0.566，95％CI 0.346～0.925，P=0.023）。多元Logistic回归分析显示年龄、LDL-C为冠心病的危险因素，脂联素为冠心病的保护因素。随着病变支数增加，脂联素水平呈逐渐降低趋势。脂联素SNP位点基因型对血清脂联素水平无明显影响。结论脂联素水平降低是高血压患者发生冠心病的独立危险因素，且随着冠脉病变程度的加重，脂联素水平逐渐降低。脂联素rs7649121位点多态性可能与高血压患者并发冠心病有关。

脂联素；多态性,单核苷酸；高血压；冠心病；Logistic模型

脂联素（adiponectin,APN）是一种脂肪细胞分泌的特异性细胞因子，研究表明脂联素与胰岛素抵抗、2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化等密切相关[1]。冠心病是高血压患者最常见的靶器官损害之一，用遗传学方法从原发性高血压人群中筛选出冠心病的易感基因，将有助于预防此人群冠心病的发生。本研究通过检测天津地区高血压患者血清脂联素水平及其4个基因位点 rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262的单核苷酸多态性（SNP），探讨脂联素及其基因多态性与高血压患者并发冠心病的关系，以及两者对冠脉病变程度的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2010年8月—2011年11月于我院心内科住院的高血压患者414例，根据是否合并有冠心病分为：单纯高血压组180例，年龄42～77岁，平均(58.82±7.82)岁，其中男93例，女87例；高血压合并冠心病组234例，年龄30～78岁，平均(59.87±9.12)岁，男123例，女111例。高血压采用世界卫生组织-国际高血压联盟（WHO-ISH）的诊断标准，即收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒张压≥90 mmHg，或既往有高血压病史，目前正在服用降压药物治疗的患者。冠心病患者符合1979年WHO诊断标准，并经冠状动脉造影证实主要冠状动脉血管（左前降支、左回旋支、右冠状动脉）至少有1支狭窄≥50％。选择同期住院的无高血压病史且血压正常患者185例为对照组，并经心电图、血液检查、心脏超声及冠脉造影检查除外心脏疾病。所有受试者均排除严重肝、肾疾病及急、慢性感染性疾病、甲状腺功能亢进或减退、全身大动脉疾病、结缔组织病、各种肿瘤及继发性高血压患者。

1.2 冠状动脉造影 采用Judkins法行冠状动脉造影，每支血管选择多体位投照，以国际通用的直径法由2名有经验的医师对造影结果进行分析。若前降支、回旋支或右冠状动脉中1支狭窄者归为单支病变，2支狭窄者归为双支病变，3支狭窄者归为3支病变。对于左主干病变，无论前降支、回旋支有无狭窄均归为双支病变。

1.3 生化指标测定 患者入院后空腹12 h采取肘正中静脉血，分离血清，采用竞争性酶联免疫吸附法（ELISA）测定脂联素水平，按照试剂盒说明书进行（RapidBio Lab，California，USA）。血总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）、空腹血糖（FPG）等生化指标采用全自动生化分析仪测定。

1.4 基因型分析 取静脉血5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，分离白细胞，采用苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法检测脂联素基因rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262位点SNP。相应引物序列见表1，由北京奥科生物技术有限公司合成。反应体系10 μL，PCR反应条件：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，55.2℃（rs266729、rs7649121）或58.5℃（rs1501299）或52.5℃（rs3774262）退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次后72℃再延伸8 min。基因产物经限制性内切酶HhaⅠ(rs266729)，BsmⅠ（rs1501299），EarⅠ（rs7649121，rs3774262）酶切后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离观察基因型，凝胶分析仪照相并记录结果。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，计数资料比较采用χ2检验，各变量与冠心病的关系采用多元二项式Logistic回归分析。应用THESIAS软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验和单倍型分析。双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组间一般临床资料及脂联素水平比较 3组间性别、年龄、吸烟史及VLDL-C水平差异无统计学意义，高血压合并冠心病组TC、TG、LDL-C及FPG水平较对照组和单纯高血压组显著升高（P＜0.05），HDL-C及APN水平较对照组和单纯高血压组显著降低(P＜0.05)，见表2。

2.2 脂联素SNP位点基因型及等位基因分布频率比较 脂联素SNP rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262基因型分布频率在3组中均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2分别为0.781、0.163、0.522、0.896、0.009、0.083、1.360、1.560、0.203、1.682、1.170、0.242，均P＞0.05），说明本研究人群具有群体代表性。rs266729等位基因频率，rs7649121基因型频率，rs1501299和rs3774262的基因型频率及等位基因频率在3组间分布差异有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

2.3 高血压患者脂联素基因多态性与冠心病的关系 在高血压患者中rs7649121位点杂合子AT基因型较纯合子AA基因型可降低冠心病风险，且这种影响在校正性别、年龄、BMI、糖尿病史、吸烟史、血脂、血糖等冠心病传统危险因素后依然存在。rs3774262位点AA基因型较GG基因型或AG/GG基因型可降低冠心病风险，但这种影响在校正冠心病传统危险因素后消失；其他2个SNP位点与冠心病无明显相关性，见表4。

Tab.1 The PCR primer sequences and the length of enzyme-digested products表1 SNP位点所用引物及酶切产物长度

2.4 高血压患者并发冠心病的多因素回归分析 以冠心病为因变量，以性别、年龄、BMI、吸烟史、糖尿病史、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FPG、APN及rs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262这 4个位点的基因多态性为自变量，进行多元二项式Logistic回归分析，结果显示年龄、LDL-C为冠心病的危险因素，脂联素为冠心病的保护因素，见表5。

2.5 病变支数与脂联素及其基因多态性的关系 随着冠脉病变支数的增加，脂联素水平逐渐降低，差异有统计学意义；不同冠脉病变支数间脂联素SNP位点基因型分布无明显差异，见表6。

2.6 脂联素基因多态性对脂联素水平的影响 脂联素SNPrs266729、rs7649121、rs1501299、rs3774262位点不同基因型间脂联素水平差异无统计学意义，见表7。

2.7 单体型分析 脂联素 SNP rs266729(C＞G)、rs7649121(A＞T)、rs1501299(G＞T)、rs3774262(G＞A)单体型在冠心病组及对照组间分布差异无统计学意义，见表8。

Tab.2 Comparison of clinical data and APN levels between three groups表2 各组临床资料及脂联素水平比较

Tab.3 Comparison of SNP genotype and allele frequency between three groups表3 脂联素SNP位点基因型及等位基因在各组间分布频率比较 例（％）

3 讨论

脂联素是由脂肪细胞分泌的在脂肪组织中含量最为丰富的基因转录产物，是脂肪细胞因子家族的重要成员之一。研究证实，脂联素具有抗动脉粥样硬化形成、抗炎症和抗内膜增生等特性，可能与糖尿病、代谢综合征、冠心病等发病有关[1]。长期高血压是促进动脉粥样硬化发生发展的重要危险因素。有研究发现，高血压患者的血浆脂联素水平明显减低，并且随着血压水平的升高，脂联素水平逐渐下降[2]。多项研究证实，低脂联素血症是冠心病的独立危险因素之一[3-4]。本研究中高血压合并冠心病组患者脂联素水平明显降低，且随着病变支数的增加脂联素水平呈逐渐下降的趋势，Logistic回归分析显示低脂联素血症为高血压患者发生冠心病的危险因素，证实了脂联素在高血压患者发生动脉粥样硬化的过程中发挥重要作用，两种疾病的叠加进一步促进了动脉粥样硬化的发生发展，脂联素可以作为反映冠脉病变严重程度的一个辅助指标，以脂联素为干预靶点的治疗可能为高血压患者的一级预防提供新的思路。

编码脂联素的基因位于染色体3q27区域，为2型糖尿病、代谢综合征及冠心病的易感位点，有较大频率的基因多态性[5]，其SNP可能通过影响血清脂联素水平而参与疾病的发生与发展。国内外已有大量研究结果显示在不同种族人群中脂联素基因多态性与疾病的相关性不尽相同。国外有研究发现，脂联素基因SNP+276 G/T（rs1501299）多态性只增加早发冠心病患者的危险性,在晚发冠心病患者中起决定作用的则是其他的心血管危险因素[6]。rs1501299 T等位基因携带者心肌梗死风险增高[7]。国内亦有研究发现rs1501299 G＞T突变增加冠心病风险，但对脂联素水平无明显影响[8]。也有研究显示rs1501299 G等位基因与冠心病风险增高有关[9-10]。亦有研究表明，SNP+276G/T与冠状动脉疾病的发生及血浆APN水平不相关[11]。大规模的荟萃分析提示rs1501299 T等位基因降低心血管病风险[12-13]。有关rs266729的研究结果也不一致，有研究提示rs266729 G等位基因增加心血管病风险[13]，荟萃分析显示rs266729与心血管疾病之间的相关性仅在亚洲人群中是显著的[13-14]。有研究显示rs7649121与糖尿病及代谢综合征相关[15-16]，但rs7649121及rs3774262位点与冠心病的相关性，目前国内外尚鲜见到报道。本研究中脂联素rs7649121位点杂合子AT基因型较纯合子AA基因型可降低高血压患者冠心病风险，rs266729、rs1501299、rs3774262则与冠心病无明显相关性，可能与人群种族差异及本研究样本量较小有关。

Tab.4 Effects of adiponectin gene polymorphism on risk factors of coronary artery disease in hypertension patients表4 脂联素基因多态性对高血压患者并发冠心病风险的影响

Tab.5 Logistic regression analysis of risk factors for coronary artery disease表5 冠心病影响因素分析

综上，脂联素作为一个脂肪细胞分泌的细胞因子，是连接代谢紊乱与心血管疾病的重要环节，高血压合并低脂联素血症患者可能更易于发生心血管疾病，早期监测高血压患者的脂联素水平，并以其为治疗靶点可能成为高血压患者一级预防与二级预防的重要措施。脂联素基因SNP与冠心病的相关性尚需进一步大样本研究加以证实。

Tab.6 Relationship between adiponectin gene polymorphism and serum adiponectin levels with the severity of coronary artery stenosis表6 病变支数与脂联素及其基因多态性的关系

Tab.7 Comparison of serum adiponectin levels in different genotype groups表7 不同基因型脂联素水平比较

Tab.8 Haplotype analysis of APN SNPs表8 脂联素SNP位点单体型分析

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（2014-02-26收稿 2014-05-23修回）

（本文编辑 李国琪）

The Association between Serum Adiponectin Levels and Gene Polymorphism with Coronary Artery Disease in Patients with Essential Hypertension

LI Yang1，QIN Qin1△，REN Bei1，ZHAO Lili1，MAO Yongmin2，ZHENG Ping1
1 Department of Cardiology，Tianjin Chest Hospital，Tianjin 300222，China；2 Tianjin Institute of Cardiovascular Disease△

E-mail:qinqin6351@163.com

ObjectiveTo observe the association between adiponectin gene polymorphism,serum adiponectin levels with the incidence of coronary artery disease(CAD)and the severity of coronary artery stenosis in patients with essential hypertension(EH).MethodsA total of 414 patients with EH(234 cases with CAD and 180 cases without CAD)and 185 control subjects were recruited in this study.Serum adiponectin levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Adiponectin single-nucleotide polymorphisms rs266729，rs7649121，rs1501299 and rs3774262 were genotyped by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).ResultsSerum adiponectin levels were significantly lower in EH with CAD group than those in control group and EH without CAD group.Adiponectin SNP rs7649121 AT genotype reduced the risk of CAD compared with AA genotype(adjusted OR=0.566，95％CI 0.346-0.925，P=0.023).Logistic regression analysis showed that age and LDL-C were risk factors of CAD,and adiponectin was the protective factor for CAD in EH patients.The severity of coronary artery stenosis was negatively related to the level of adiponectin.Adiponectin levels were not affected by the adiponectin gene polymorphism.ConclusionThe decreased serum adiponectin level was the independent risk factor for CAD in EH patients,which was negatively related to the severity of coronary artery stenosis.Adiponectin SNP rs7649121 may contribute to the risk factors of CAD in EH patients.

adiponectin;polymorphism,single nucleotide;hypertension;coronary disease;Logistic models

R541

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.014

天津市卫生局科技基金项目（2006KR11）

1天津市胸科医院心内科（邮编300222）；2天津市心血管病研究所

△通讯作者 E-mail:qinqin6351@163.com