人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注大鼠nNOS、iNOS表达的影响

屈惠莹袁 静 包翠芬秦书俭

人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注大鼠nNOS、iNOS表达的影响

屈惠莹1袁 静2△包翠芬1秦书俭1

目的 探讨人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织一氧化氮合酶（NOS）表达的影响。方法将30只大鼠随机分成假手术组、脑缺血再灌注组、Rg1-L组、Rg1-M组、Rg1-H组及尼莫地平组，每组5只。采用大鼠中动脉栓塞法制作大鼠脑缺血再灌注模型，观察大鼠再灌注后神经功能缺损情况，采用硝酸还原酶法和比色法检测大鼠血清中NO、神经型NOS（nNOS），诱导型NOS（iNOS）的含量，应用免疫组化和免疫印迹法检测脑缺血再灌注后nNOS、iNOS的表达。结果（1）Rg1-L组、Rg1-M组、Rg1-H组大鼠的脑缺血后神经功能评分明显低于脑缺血再灌注组（2.40±0.55、1.80±0.84、1.60±0.89 vs 3.20±0.84，P＜0.05）。（2）与脑缺血再灌注组相比，3个Rg1组大鼠血清中NO 和iNOS含量降低，nNOS含量增高。（3）与脑缺血再灌注组相比，3个Rg1组大鼠脑组织中nNOS表达增高，iNOS表达降低。结论人参皂苷Rg1防治大鼠脑缺血再灌注损伤的机制可能与激活nNOS、抑制iNOS有关。

人参皂苷；一氧化氮合酶；一氧化氮；脑缺血再灌注

脑缺血疾病有发病率高、致残率高、致死率高的特点，目前临床上的治疗主要以溶栓使血管再通为主，但是缺血再灌注造成的损伤不可避免，如何解决缺血再灌注损伤已成为当今的研究热点。人参皂苷Rg1主要存在于人参属药材中，是人参的主要成分之一。研究表明，脑缺血再灌注后，人参皂苷Rg1可明显改善大鼠的神经功能，减少脑梗死体积并减轻脑水肿程度[1]。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是一种同工酶，主要分为3个亚型，神经型NOS（nNOS或NOS1）、诱导型NOS（iNOS或NOS2）和内皮型NOS（eNOS或NOS3），脑缺血后主要通过nNOS和iNOS影响NO的含量[2]。已有研究报道人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注大鼠caspase-3[3]、Bax[4]等因子表达的影响，但关于人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注大鼠nNOS和iNOS表达影响的相关文献尚少，本研究通过制作大鼠脑缺血再灌注模型，检测脑组织缺血再灌注后nNOS和iNOS的表达，探讨nNOS和iNOS在脑缺血再灌注中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 人参皂苷Rg1(纯度＞95％)购自吉林大学有机化学教研室，经生理盐水稀释后备用；尼莫地平注射液(批号071001)购自山西亚宝药业；nNOS和iNOS抗体购自SANTA CRUZ公司，PV6001试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，大鼠NO、nNOS和iNOS试剂盒购自南京建成试剂公司。其他实验试剂均由辽宁医学院科学实验中心提供。

1.2 实验动物及分组 健康SPF级SD大鼠30只，雄性，体质量250～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证：SCXK(京)2012-0001]，随机均分为6组：（1）假手术组。（2）脑缺血再灌注组。（3）Rg1-L组。（4）Rg1-M组。（5）Rg1-H组。（6）尼莫地平组即阳性药物对照组。分别于术前5 d至取材当日给（3）～（5）组腹腔注射10、20、40 mg/kg人参皂苷Rg1，（6）组注射1 mg/kg尼莫地平，其余2组注射等量生理盐水，1次/d。

1.3 大鼠右侧局灶性脑缺血(MCAO)模型的制备 10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，采用线栓法[5]制备大鼠MCAO模型。线栓采用头端光滑烫圆的直径0.23 mm鱼线，长度由右侧颈外动脉分叉部计约（18.5±0.5）mm，假手术组插入深度小于15 mm。栓塞2 h后，将鱼线轻轻拔出并缝合皮下筋膜及皮肤，即为再灌注模型，再灌注时间为24 h。术中保持肛温在37.0～37.5℃。

1.4 神经功能评分 待动物清醒后，参考Longa等[6]的5分制评分标准评价其神经功能：0分，无明显神经病学症状；1分，不能完全伸展左侧前爪；2分，向左侧旋转；3分，行走时向左侧倾倒；4分，不能自动行走，意识水平下降。1～3分的大鼠为造模成功，剔除不符合条件及死亡的大鼠。对于实验中剔除及死亡的大鼠均按严格的实验条件统一补充。

1.5 大鼠血清中NO、nNOS和iNOS含量的测定 MCAO术后24 h，将各组大鼠麻醉，于右心房取血5 mL，室温静置2～3 h，待血液凝固后，以1 500 r/min离心5 min，去上清液后于-20℃保存备用，采用硝酸还原酶法测定血清NO含量，采用比色法测定血清nNOS、iNOS含量，具体方法参照试剂盒说明书。

1.6 免疫组化法检测大鼠脑组织中nNOS和iNOS的表达 MCAO术后24 h，将各组大鼠麻醉，4％多聚甲醛灌流固定，断头取脑，10％中性福尔马林固定6～12 h，乙醇逐级脱水，定向包埋，连续切片（厚度5 μm）。采用高压加热法修复抗原，PBS漂洗，每张切片滴加适当比例稀释的nNOS、iNOS抗体，4℃过夜，次日取出，每张切片滴加辣根过氧化物酶标羊抗大鼠多聚体，37℃孵育，PBS漂洗，DAB显色，镜下观察至出现背景染色时，置于蒸馏水内终止反应。苏木精染液复染后，脱水，透明，封片，镜下观察。采用PBS替代一抗作为阴性对照。采用CIAS图像分析系统检测每高倍镜视野下阳性蛋白表达的平均灰度。

1.7 免疫印迹法检测大鼠脑组织中nNOS和iNOS的表达 MCAO术后24 h，将各组大鼠麻醉，4％多聚甲醛灌流固定，断头取脑，迅速放入液氮内冷冻，超低温冰箱内保存。检测前取适量的冷冻组织，裂解吸取上清液，采用BCA法测定蛋白含量，电泳，半干转印，TBST冲洗后，5％血清白蛋白于室温下封闭。加入适当比例稀释的nNOS和iNOS抗体，4℃过夜，次日滴加适当比例稀释的二抗，室温孵育，增强化学发光法显色，内参采用β-actin蛋白。扫描条带，用光密度软件分析电泳条带光密度。以目的条带与内参条带光密度的比值表示待测蛋白的含量。

1.8 统计学方法 实验数据用SPSS 13.0软件包进行统计分析，各指标用均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分 假手术组大鼠未见明显的神经功能缺损。脑缺血再灌注组大鼠可见有明显的神经功能缺失症状，给予人参皂苷Rg1后，Rg1-L组、Rg1-M组、Rg1-H组神经功能缺失程度均较脑缺血再灌注组减轻，但仍较假手术组严重(P＜0.05)，见表1。

2.2 各组大鼠血清 NO、nNOS和 iNOS水平比较 （1）NO:假手术组NO正常，脑缺血再灌注组NO含量明显高于其他各组。给予人参皂苷Rg1后，3 个Rg1组的血清NO含量均低于脑缺血再灌注组，与假手术组无显著差异，Rg1-M组、Rg1-H组的NO含量与尼莫地平组无显著差异（均P＞0.05），但Rg1-L组高于尼莫地平组。（2）nNOS：假手术组nNOS正常，脑缺血再灌注组nNOS含量明显低于假手术组，给予人参皂苷Rg1后，Rg1-L组与脑缺血再灌注组无显著差异（P＞0.05），但Rg1-M组、Rg1-H组的nNOS含量高于脑缺血再灌注组，但与尼莫地平组及假手术组无显著差异（P＞0.05）。（3）iNOS:假手术组iNOS含量较少，脑缺血再灌注组iNOS含量明显高于其他各组。给予人参皂苷Rg1后，3个Rg1组的iNOS含量均低于脑缺血再灌注组，与假手术组无显著差异。Rg1-M组、Rg1-H组的iNOS含量与尼莫地平组无显著差异，但Rg1-L组高于尼莫地平组，见表1。

2.3 免疫组化法检测nNOS和iNOS结果 （1）nNOS：假手术组为正常神经细胞，体积大，核着色浅，核仁清晰，细胞质内可见少量浅黄色或黄色的nNOS染色颗粒。脑缺血再灌注组部分神经细胞体积缩小，细胞呈三角形或梭形，细胞周围间隙增宽，核色深，核仁不明显，有的细胞质内可见黄色的nNOS染色颗粒。人参皂苷Rg1各组细胞形态均有不同程度的改善，且见明显的nNOS染色颗粒，见图1。（2）iNOS：假手术组为正常神经细胞，体积大，核着色浅，核仁清晰，细胞质内偶见浅黄色或黄色的iNOS染色颗粒。脑缺血再灌注组部分神经细胞体积缩小，细胞呈三角形或梭形，细胞周围间隙增宽，核色深，核仁不明显，有的细胞质内可见明显的黄色或棕黄色的iNOS染色颗粒。人参皂苷Rg1各组细胞形态均有不同程度的改善，且见少量的iNOS染色颗粒，见图2。

2.4 免疫印迹检测nNOS和iNOS的表达结果 （1）nNOS:假手术组nNOS正常表达，脑缺血再灌注组nNOS表达低于假手术组，给予人参皂苷Rg1后，Rg1-L组与脑缺血再灌注组之间无显著差异（P＞0.05），但Rg1-M组、Rg1-H组nNOS表达高于脑缺血再灌注组，且其表达水平与尼莫地平组及假手术组无显著差异（P＞0.05）。（2）iNOS:假手术组iNOS少量表达，脑缺血再灌注组iNOS表达明显高于其他各组。给予人参皂苷Rg1后，3个Rg1组的iNOS水平低于脑缺血再灌注组，与假手术组无显著差异。Rg1-M组、Rg1-H组的iNOS表达水平与尼莫地平组无显著差异，但Rg1-L组高于尼莫地平组，见表2，图3。

Tab.1 Comparision of neurological scores and contents of NO,nNOS and iNOS in six groups of rats表1 各组大鼠神经功能评分及NO、nNOS及iNOS含量比较 （n=5，±s）

Tab.1 Comparision of neurological scores and contents of NO,nNOS and iNOS in six groups of rats表1 各组大鼠神经功能评分及NO、nNOS及iNOS含量比较 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a与假手术组比较，b与脑缺血再灌注组比较，c与Rg1-M组比较，d与尼莫地平组比较，P＜0.05

组别假手术组脑缺血再灌注组Rg1-L组Rg1-M组Rg1-H组尼莫地平组F神经功能评分（分）0 3.20±0.84a2.40±0.55abd1.80±0.84ab1.60±0.89ab1.80±0.45ab3.963＊NO(μmol/L) 11.72±2.15 20.49±3.08a13.98±2.01bd11.16±0.91b6.25±0.43b8.23±0.30b38.653＊组别假手术组脑缺血再灌注组Rg1-L组Rg1-M组Rg1-H组尼莫地平组F nNOS（U/mg）147.78±25.40 10.49±4.15a26.88±16.07c87.85±16.93b159.38±24.42b106.60±17.94b53.034＊iNOS（U/mg）20.25±17.78 208.75±17.49a134.06±15.59bd100.06±16.24b35.12±9.15b54.06±31.30b69.200＊

Tab.2 Optical density values of nNOS and iNOS in six groups表2 各组大鼠nNOS、iNOS光密度值（n=5，±s）

Tab.2 Optical density values of nNOS and iNOS in six groups表2 各组大鼠nNOS、iNOS光密度值（n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a与假手术组比较，b与脑缺血再灌注组比较，c与Rg1-M组比较，d与尼莫地平组比较，P＜0.05

组别假手术组脑缺血再灌注组Rg1-L组Rg1-M组Rg1-H组尼莫地平组F nNOS/β-actin 0.393 6±0.059 7 0.080 0±0.048 6a0.166 4±0.040 5cd0.321 3±0.064 9b0.419 1±0.107 1b0.356 8±0.062 4b12.225＊＊iNOS/β-actin 0.068 7±0.007 1 0.360 6±0.089 2a0.250 2±0.087 5bd0.151 5±0.025 7b0.086 7±0.042 4b0.100 5±0.024 4b12.535＊＊

Fig.3 The expression levels of nNOS/iNOS protein in cerebral tissues in six groups图3 nNOS/iNOS在各组大鼠脑组织的表达

3 讨论

人参被誉为“滋阴补生，扶正固本”之极品，其主要的药理作用通过人参皂苷表现，据文献报道，当归补气汤[7]，芪菖治瘫口服液[8]、莲心碱[9]、茶色素[10]、MC-002[11]、葛根黄酮[12]等均可抑制NOS表达，降低NO的神经毒性。脑缺血再灌注损伤主要与兴奋性氨基酸毒性、自由基及脂质过氧化[13]、热休克蛋白表达紊乱、NO含量和Ca2+超载有关[14-15]。NOS是NO产生的关键酶，脑缺血后，神经末梢释放大量的谷氨酸，刺激N-甲基-D-天门冬氨酸受体，导致细胞中Ca2+浓度升高，NOS活性增强，NO产生量增加。且脑缺血后，ATP大量消耗，能量代谢障碍及cAMP依赖性蛋白激酶活性下降，使NOS脱磷酸化，NOS的活性增强[16]。NO能扩张血管[17]，增加血流量，改善缺血组织血供[18]，抑制血小板凝集[19]，但是高浓度的NO则会对机体及组织造成损害，引起组织氧化应激损伤。脑缺血再灌注后，神经细胞中的nNOS减少，不利于脑组织缺血再灌注，不同于nNOS，iNOS只在细胞受到刺激后被激活而发挥作用，且产生的NO也较多，NO具有神经毒性，不利于脑组织的再灌注，还会加重脑缺血损伤程度[20]。

本实验通过测定大鼠脑组织中NO、nNOS和iNOS的含量以及脑组织中nNOS和iNOS的表达，结果显示，假手术组NO含量较少，脑缺血再灌注组NO含量明显高于其他各组，给予人参皂苷Rg1后，3个Rg1组NO含量低于脑缺血再灌注组；假手术组nNOS正常表达，脑缺血再灌注组nNOS表达明显低于假手术组，Rg1-M组、Rg1-H组nNOS表达高于脑缺血再灌注组；假手术组iNOS少量表达，脑缺血再灌注组iNOS表达明显高于其他各组，给予人参皂苷Rg1后，3个Rg1组的iNOS水平低于脑缺血再灌注组，表明脑缺血再灌注后nNOS明显减少，应用人参皂苷Rg1可以激活脑缺血再灌注后nNOS的活性，使NO产生量增加，有利于脑组织血管扩张，增加脑组织的血流量，改善脑组织血供，而iNOS在细胞受到刺激后产生，产生有毒性作用的NO也较多，影响脑缺血再灌注后的恢复，应用人参皂苷Rg1后，iNOS的表达水平降低，产生的具有神经毒性的NO也随之减少，将有利于脑组织的再灌注及减少脑缺血的损伤程度。

Fig.1 nNOS expressions in cerebral tissues in six groups(DAB dyeing,×400)图1 nNOS在大鼠脑组织的表达（DAB染色,×400）

Fig.2 iNOS expressions in cerebral tissues in six groups(DAB dyeing,×400)图2 iNOS在大鼠脑组织的表达（DAB染色,×400）

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(2014-05-23收稿 2014-06-30修回)

（本文编辑 闫娟）

Effects of Ginsenoside Rg1 on nNOS and iNOS Expressions in Rat Brain Tissue after Cerebral Ischemia Reperfusion

QU Huiying1，YUAN Jing2△，BAO Cuifen1，QIN Shujian1
1 Department of Human Anatomy＆Histology and Embryology，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2 The First Affiliated Hospital，Liaoning Medical College△

E-mail：mianyizuhua@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the effects of Ginsenoside Rg1 on the expression of nitric oxide synthase (NOS)in brain tissue after cerebral arterial thrombosis in adult rats.MethodsThirty rats were randomly divided into the sham-operative group,cerebral ischemia-reperfusion group,Ginsenoside Rg1-L group,Ginsenoside Rg1-M group,Ginsenoside Rg1-H group and nimodipine group(n=5 for each group).The ischemia-reperfusion rat model was established by middle cerebral artery occlusion.The neurological score after reperfusion was observed.The levels of nitric oxide(NO),neuronal NOS(nNOS)and inducible NOS(iNOS)were detected by nitrate reduction method and colorimetric method.The expressions of nNOS and iNOS after reperfusion were analyzed by immunohistochemistry and Western blot assay.Results(1)The neurological scores after cerebral ischemia were significantly lower in Rg1-L group,Rg1-M group and Rg1-H group than those of cerebral ischemia-reperfusion group（2.40±0.55,1.80±0.84,1.60±0.89 vs 3.20±0.84，P＜0.05).(2)Compared with those of model group,serum levels of NO and iNOS were reduced,and nNOS levels increased,in three groups of Rg1.(3)Compared with those of model group,the expression of nNOS was significantly increased，and iNOS expression was significantly reduced,in three groups of Rg1.ConclusionThe preventive effects of Ginsenosides Rg1 on cerebral ischemia-reperfusion injury may be associated with the activation of nNOS and the inhibition of iNOS.

ginsenoside;nitric oxide synthase；nitric oxide；cerebral ischemia reperfusion;

R282

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.09.010

国家自然科学基金项目（31170930、81202783）

1辽宁锦州，辽宁医学院人体解剖与组织胚胎学教研室（邮编121000）；2辽宁医学院附属第一医院神经内科

△通讯作者 E-mail：mianyizuhua@aliyun.com