鞘内注射阿片复合纳洛酮对切口痛大鼠痛行为学及血浆胃动素的影响

赵 军高宝柱△ 郑宝森曹君利

鞘内注射阿片复合纳洛酮对切口痛大鼠痛行为学及血浆胃动素的影响

赵 军1高宝柱1△郑宝森2曹君利3

目的 观察鞘内注射吗啡、芬太尼复合小剂量纳洛酮对切口痛大鼠痛行为学及血浆胃动素（MTL）的影响。方法取鞘内置管成功的健康雄性SD大鼠72只，随机分为6组（n=12）：生理盐水（NS）组，切口痛（P）组，吗啡（5 μg/kg）＋芬太尼（0.25 μg/kg）组（MFP组），吗啡＋芬太尼+纳洛酮1（0.2 ng/kg）、2（1 ng/kg）、3（5 ng/kg）组（MFPN1、2、3组）。后5组行足跖肌切口。各组取其中6只于鞘内置管前24 h（T0）、造模前24 h（T1）、术后1 h（T2）、3 h（T3）、6 h（T4）、24 h（T5）、48 h（T6）、72 h（T7）检测机械缩足阈值（PWMT）与热缩足反射潜伏期（PWTL），剩余6只于术后6 h即刻断头处死，取血浆以ELISA法检测MTL浓度。结果MFPN2组与NS组各时点PWMT差异无统计学意义，而与NS组相比，T2、T5时点PWTL上调（P＜0.05），其余各时点差异无统计学意义。P组、MFPN3组与NS组比较，T2、T3、T4时点PWMT、PWTL显著下调（P＜0.05）。而MFPN3组与P组比较，T6时点PWMT及T3、T4时点PWTL下调更为显著（P＜0.05）。P、MFP、MFPN1、MFPN3组与NS组比较，术后6 h MTL表达下调（P＜0.05）。而MFPN2 与NS组MTL表达差异无统计学意义。结论鞘内注射1 ng/kg纳洛酮抑制了吗啡＋芬太尼对切口痛大鼠血浆MTL表达的影响，并能上调大鼠热辐射痛阈值，增强了阿片类药物的镇痛效果。

促胃动素；吗啡；纳洛酮；芬太尼；切口痛；胃肠动力

胃动素（motilin，MTL）在外周主要分布于胃、十二指肠、空肠上段及血浆，参与调节胃肠平滑肌细胞收缩的信号通路，可通过加强胃肠道平滑肌的收缩，引起胃肠蠕动能力增强，在胃肠动力调控中起重要作用[1-2]。有文献表明，阿片类药物可通过下调胃肠道内MTL分泌，降低胃肠蠕动能力[3-4]。而小剂量纳洛酮可逆转阿片类药物对胃肠MTL的影响，同时不减弱其镇痛效果[5]。但不同剂量纳洛酮在急性疼痛及阿片类药物镇痛条件下对镇痛效果、血浆MTL表达的影响及机制尚不清楚。本研究拟探讨鞘内注射小剂量纳洛酮复合吗啡、芬太尼对切口痛大鼠痛行为学及血浆MTL表达的影响，为临床研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量180～220 g，徐州医学院实验动物中心提供。每笼5只饲养，自然照明，自由摄食、饮水；MTL ELISA试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司，进口分装）；吗啡（批号：091204-1，东北制药集团公司沈阳第一制药厂）；芬太尼（批号：100302，湖北宜昌人福药业有限责任公司）；纳洛酮（批号：h20093199，国药集团国瑞药业有限公司）；PE10导管（宁波安来软件科技有限公司）；Von Frey纤维丝（IITC公司，美国）；热痛刺激仪Model 390 Heated Base（IITC公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 鞘内置管 参照文献[6]方法行鞘内置管。大鼠清醒后24 h观察其活动情况，剔除运动功能障碍大鼠。鞘内注射2％利多卡因20 μL，出现双后肢麻痹为置管成功。

1.2.2 疼痛模型制备 参照Brennan法[7]，大鼠七氟烷吸入麻醉后右足底近端0.5 cm处向趾部做一长约1 cm切口，切开皮肤筋膜，用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割，但保持肌肉起止及附着完整，皮肤缝合，切口以青霉素药液冲洗。

1.2.3 分组及给药方法 鞘内置管89只，其中术后死亡9只，给予利多卡因后单侧后肢麻痹8只，弃用。取置管成功大鼠72只，采用随机数字表法分为6组（n=12）：生理盐水（NS）组、切口痛（P）组、吗啡＋芬太尼（MFP）组、吗啡＋芬太尼+纳洛酮1（MFPN1）组、吗啡＋芬太尼+纳洛酮2（MFPN2）组、吗啡＋芬太尼+纳洛酮3（MFPN3）组。P组、MFP组、MFPN1组、MFPN2组、MFPN3组行右后足跖肌切口；MFP组、MFPN1组、MFPN2组、MFPN3组在造模前20 min鞘内分别给予吗啡5 μg/kg+芬太尼0.25 μg/kg混合液。MFPN1组、MFPN2组、MFPN3组分别鞘内给予纳洛酮0.2、1、5 ng/kg。NS组、P组给予NS。各组药液均以NS稀释至50 μL鞘内注射。

1.2.4 指标测定 各组取其中6只于鞘内置管前24 h（T0），造模前24 h（T1），术后1 h（T2）、3 h（T3）、6 h（T4）、24 h（T5）、48 h（T6）、72 h（T7）检测痛行为学指标，包括机械缩足阈值（PWMT）和热缩足反射潜伏期（PWTL）。各组取剩余6只，术后6 h即刻断头处死，取血浆，以ELISA法检测MTL浓度。（1）PWMT测定。将一透明有机玻璃箱（其中每一隔间尺寸为22 cm×22 cm×12 cm）置于30 cm高的金属筛网（网格1 cm×1 cm）上，待大鼠在箱中适应30 min后，以电子Von Frey纤维丝垂直，以相同强度刺激大鼠左右后足与附近第3、4趾间皮肤，每次持续4～6 s。大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应。记录刺激强度数值，每次间隔15 s以上，共刺激5次，计算其平均值为PWMT。（2）PWTL测定。将有机玻璃箱置于3 mm厚玻璃板上，大鼠放入箱内，使其自由活动30 min以适应测试环境和温度。室温稳定在（25±1）℃。用热辐射仪照射大鼠足底紧贴玻璃板部位。与PWMT测定部位相同。记录照射开始至大鼠出现抬足或舔足时间，截止时间为20 s，以防止组织损伤。实验中，热刺激强度保持相同。每只动物重复5次，每次间隔至少5 min，取后刺激3次的平均值为PWTL。（3）MTL测定。开腹经下腔静脉抽血2 mL，置于含30 μL 10％EDTA二钠和40 μL抑肽酶（2万U/ mL）试管中混匀，4℃、3 500 r/min离心20 min，取血浆置于-20℃冰箱保存。以ELISA法同批检测MTL浓度。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。采用重复测量资料的方差分析或单因素方差分析，组间比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时点大鼠PWMT变化 见表1。MFPN2组各时点PWMT与NS组比较差异无统计学意义（P＞0.05），P组、MFPN3组T2～T6时点PWMT与NS组比较降低（P＜0.05）。MFP组与NS组比较，PWMT于T5开始降低（P＜0.05），于T6升高至生理水平，表明该剂量吗啡＋芬太尼对机械痛刺激镇痛时效不超过24 h。与P组比较，MFPN3组PWMT 于T6时点显著降低（P＜0.05）。

Tab.1 Changes of PWMT at different time points in six groups表1 不同时点对各组大鼠PWMT变化 （n=6，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与NS组比较，b与P组比较，c与MFP组比较，d与MFPN1组比较，e与MFPN2组比较,P＜0.05；表2、3同；F时间= 12.345、F交互=4.141、F组间=7.864，均P＜0.01

组别NS组P组MFP组MFPN1组MFPN2组MFPN3组F T0 42.1±7.6 41.0±8.3 42.1±8.6 41.4±5.8 42.6±5.0 42.6±5.0 0.236 T1 44.0±11.8 41.0±8.2 40.3±12.6 42.2±16.4 42.5±8.7 40.3±12.6 0.476 T2 42.6±10.6 19.1±7.6a46.0±9.2b41.3±9.2b42.0±6.7b23.4±3.4acde12.330＊＊T3 44.0±7.1 16.3±4.9a46.5±13.2b40.0±3.7b41.5±13.5b23.3±6.6acde11.651＊＊T4 43.0±8.7 17.5±5.3a40.0±8.7b34.9±5.1b39.1±14.7b24.6±5.6acde12.034＊＊T5 42.6±6.6 24.7±10.4a32.4±14.4a27.3±3.3a38.5±14.8bd30.0±6.3ae3.522＊T6 41.8±7.3 30.1±12.7a42.7±5.2b33.9±3.4 38.9±19.0b19.8±4.8abcde6.302＊＊T7 43.3±6.1 40.1±7.9 51.8±9.7 39.5±2.3 42.6±20.2 35.1±10.5c1.750

2.2 不同时点大鼠PWTL变化 MFPN2与NS组比较，T2、T5时点PWTL延长（P＜0.05），其余各时点差异无统计学意义。P组与NS组比较，T2、T3、T4时点PWTL缩短（P＜0.05）。MFPN3组与NS组比较，T2～T6时点PWTL缩短（P＜0.05）。MFPN1组与NS组比较，于T4时点PWMT缩短（P＜0.05），表明0.2 ng/kg剂量纳洛酮使用后轻度影响了吗啡＋芬太尼镇痛效果，使有效镇痛时间缩短。与P组比较，MFPN3组于T3、T4时点PWTL缩短（P＜0.05），表明MFPN3组在上述时点可能出现热痛超敏现象，见表2。

Tab.2 Changes of PWTL at different time points in six groups表2 不同时点对各组大鼠PWTL变化（n=6，g，±s）

Tab.2 Changes of PWTL at different time points in six groups表2 不同时点对各组大鼠PWTL变化（n=6，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F时间=1.677，P＞0.05；F交互=2.131，P＜0.01；F组间=9.123，P＜0.01

组别NS组P组MFP组MFPN1组MFPN2组MFPN3组F T0 10.2±1.6 12.9±2.5 11.1±2.4 10.1±1.8 11.2±2.4 9.2±2.3 0.837 T1 12.0±2.5 11.8±3.8 10.2±3.1 10.3±3.7 12.5±2.8 10.2±3.1 0.464 T2 11.1±3.2 8.7±2.1a11.2±4.3 13.3±3.5b15.1±4.5abc7.3±2.1acde4.689＊＊T3 12.6±2.4 7.3±1.9a11.5±3.2b13.2±4.0b13.4±4.9b4.7±2.6abcde8.768＊＊组别NS组P组MFP组MFPN1组MFPN2组MFPN3组F T4 12.0±2.2 8.6±3.9a10.1±2.9 7.2±0.8a13.1±6.8b4.4±2.2abce6.282＊＊T5 11.4±1.6 9.4±5.9 8.0±1.3 10.1±4.2 14.8±5.5abcd7.0±1.0ae4.012＊＊T6 11.0±1.4 9.7±3.6 9.2±1.6 12.0±4.9c13.4±4.9c6.3±0.4ade3.017＊T7 11.2±2.4 10.3±2.4 10.3±1.4 12.9±5.1 12.7±2.4 9.6±1.1 2.322

2.3 MTL的变化 MFPN2组与NS组比较MTL表达差异无统计学意义[（228.5±23.6）pmol/L vs（239.6± 3.3）pmol/L，P＞0.05]。与 NS组比较，P、MFP、MFPN1、MFPN3组表达下调[分别为146.3±20.3）、（180.9±12.0）、（182.0±35.7）、（162.8±21.9）pmol/L，F= 13.987，P＜0.01]；与P组比较，MFPN2组表达上调；与MFP组比较，MFPN2组表达上调；MFPN3组较MFPN2组表达下调；P组与MFPN3组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 前期研究及本研究的相关性及实验方法的依据 本课题组前期研究结果表明，子宫切除术患者术前鞘内注射吗啡复合芬太尼可取得满意的术后镇痛效果[8]，但术后胃肠道并发症发生概率较高；而小剂量纳洛酮可不降低阿片类药物镇痛效果，同时减少胃肠道并发症[5,9]，因此本研究选择吗啡+芬太尼复合小剂量纳洛酮给药，在保证镇痛效果前提下，评价其对血浆MTL的影响，进而评估其对胃肠动力的影响。Spofford等[10]研究表明，切口痛大鼠痛觉过敏以术后24 h内最明显。预实验结果表明，鞘内注射吗啡5 μg/kg+芬太尼0.25 μg/kg以及纳洛酮1 ng/kg复合上述剂量吗啡+芬太尼均可保证术后6 h有效镇痛；因此本研究选择于术后6 h取标本，以避免镇痛不全对MTL的影响。

3.2 超小剂量纳洛酮增加镇痛效果的机制 Tsai 等[3-4,9]研究发现，超小剂量纳洛酮通过促进谷氨酸转运体（L-glutamate transporters，GTs）表达的下调以及抑制脊髓神经元炎性反应等机制，可修复或增强吗啡对百日咳毒素处理大鼠的热痛敏的抗伤害作用。本研究结果表明，鞘内给予1 ng/kg纳洛酮复合吗啡芬太尼，术后72 h内可保持切口痛大鼠PWMT接近于NS组，同时其PWTL（T2、T5）上调。此结果与Tsai等[3-4,9]研究结果一致，再次验证小剂量纳洛酮与阿片类药物复合可不降低甚至增强镇痛效果的结论，表明该剂量纳洛酮在选择性阻断Gs蛋白偶联阿片受体的兴奋性作用中，对中枢热辐射痛调控影响更显著，这可能和参与热辐射痛调控的阿片受体与G蛋白偶联程度变化有关，同时小剂量纳洛酮还可通过下调GTs表达，从而抑制兴奋性氨基酸的释放后再摄取而强化吗啡的镇痛作用[9]。在本研究中，MFPN3组的PWMT与PWTL给药后各时点均接近或低于P组，说明该剂量纳洛酮已完全拮抗吗啡+芬太尼的镇痛作用，尤其切口侧PWTL甚至低于P组，表明大剂量纳洛酮可能参与中枢痛觉敏化的形成。临床上常见术后给予纳洛酮拮抗阿片类药物后，患者疼痛加重、烦躁不安等，可能与纳洛酮介导的热痛阈值下调有关。

3.3 切口痛、阿片类药物及不同剂量纳洛酮对血浆胃动素的影响 研究显示，肠易激综合征患者血浆MTL水平显著升高；而糖尿病性胃轻瘫患者血浆MTL水平显著下降，静脉给予MTL后，症状明显改善，表明血浆MTL与胃肠动力呈正相关，其血浆浓度变化趋势可以间接体现胃肠动力状态[11-12]。本研究显示，用1 ng/kg纳洛酮复合吗啡+芬太尼可以抑制切口痛、阿片类药参与的MTL表达的变化，进而参与稳定大鼠胃肠动力。有文献报道阿片类药物用于术后镇痛引起的胃肠道不适，如恶心呕吐等与MTL升高有关[13]。但本研究显示，疼痛与阿片类药物及大剂量纳洛酮可下调血浆MTL表达，原因可能是由于阿片类药对MTL影响呈剂量依赖有关。本研究阿片类药物剂量较小，可能对血浆MTL表达呈抑制作用。切口痛6 h后，除MFPN2组，其余各组血浆MTL表达均显著下调，提示胃肠动力减退，这与临床术后患者疼痛、阿片类药物镇痛及纳洛酮剂量使用不当引起患者胃肠功能减弱的临床症状相吻合。因此，血浆MTL可能作为术后胃肠动力的检测指标，但其发挥早期预警及用药指导作用还需进一步研究证实。

总之，鞘内注射1 ng/kg纳洛酮抑制了吗啡芬太尼、切口痛对大鼠血浆MTL表达的影响，并能上调大鼠热辐射痛阈值，增强阿片类药物的镇痛效果。

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（2014-03-06收稿 2014-07-11修回）

（本文编辑 李鹏）

Effects of Intrathecal Injection of Opioid Compound with Low-Dose Naloxone on Pain Behavior and Blood Motilin in a Rat Model of Incisional Pain

ZHAO Jun1,GAO Baozhu1△,ZHENG Baosen2,CAO Junli3
1Department of Anesthesiology,the Third Central Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300170,China; 2 The Second Affiliated Hospital of Tianjin Medical University;3 Xuzhou Medical College
△

E-mail:gbz1953@126.com

ObjectiveTo investigate effects of intrathecal injection of morphine and fentanyl combined with lowdose naloxone on the pain behavior and the expression of blood motilin(MTL)in the rat model of incisional pain．MethodsA total of 72 healthy male Sprague-Dawley rats(weight 180-220 g),successfully intrathecally catheterized,were randomly divided into 6 groups(n=12):normal saline group(NS group),incisional pain group(P group),morphine(5 μg/kg)+ fentanyl(0.25 μg/kg)group(MFP group),morphine+fentanyl+naloxone(0.2 ng/kg,1 ng/kg,5 ng/kg)group(MFPN1,MFPN2 and MFPN3 groups).All groups except NS group were made the model of incisional pain on the right plantar surface.At 24-hours before intrathecal cathetherization(T0),24-hours before modelling(T1),1-hours(T2),3-hours(T3),6-hours (T4),24-hours(T5),48-hours(T6)and 72-hours(T7)after modelling respectively,paw withdrawal mechanical threshold (PWMT)and paw withdrawal thermal latency(PWTL)were detected in right hind paw in 6 rats of each group.The other 6 rats in each group were sacrificed 6-hour after operation.The plasma expression of motilin was detected by ELISA.ResultsCompared with NS group,the PWMT was not significantly different in all time points in MFPN2 group.The values of PWTL were significantly longer at T2 and T5 in MFPN2 group than those of NS group(P＜0.05)．The PWMT and the PWTL were significantly decreased at T2,T3 and T4 in P and MFPN3 groups than those of NS group(P＜0.05)．Compared with P group,the PWMT at T6,and PWTL at T3 and T4 were significantly decreased in MFPN3 group(P＜0.05).The MTL at T6 was significantly decreased in P,MFP,MFPN1 and MFPN3 groups compared with that of NS group(P＜0.05).There was no significant difference in MTL between MFPN2 group and NS group(P＞0.05)．ConclusionIn the rat model of incisional pain,intrathecal injection of naloxone at 1 ng/kg can inhibit the down-regulation of blood motillin caused by morphine and fentanyl,and which can up-regulate the PWTL,enhancing the analgesic effects of opioids．

motilin；morphine；naloxone；fentanyl；incisional pain；gastrointestinal dynamics

R614.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.008

天津市卫生局科技基金资助项目（2010KZ19）

1天津市第三中心医院麻醉科（邮编300170）；2天津医科大学第二医院疼痛治疗中心；3徐州医学院江苏省麻醉与镇痛应用技术重点实验室

△通讯作者 E-mail：gbz1953@126.com