SDF-1/CXCR4对大肠癌细胞株SW480增殖、迁移及侵袭的影响及意义

2014-07-05袁丽倩郑淑芳

天津医药 2014年11期

袁丽倩郑淑芳

袁丽倩1郑淑芳2△

目的探讨基质细胞衍生因子-1(SDF-1)及其特异性受体CXC趋化因子受体4（CXCR4）对大肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭能力的影响及意义。方法取对数生长期大肠癌细胞SW480分为对照组(未经任何处理)、SDF-1组（加入100 μg/L SDF-1）、SDF-1＋AMD3100混合组(向细胞中加入1 mg/L AMD3100，孵育2 h后加入100 μg/L SDF-1)、AMD3100组（加入1 mg/L AMD3100）。免疫组化法检测SW480细胞中CXCR4蛋白表达情况；RT-PCR法检测SW480细胞中CXCR4 mRNA的表达情况，以及外源性SDF-1和AMD3100作用后CXCR4 mRNA表达水平的变化；MTT增殖实验、Transwell迁移及侵袭实验分别检测SDF-1以及AMD3100对SW480细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果SW480细胞中CXCR4蛋白呈阳性表达（阳性率80％）。SW480细胞中有CXCR4 mRNA的表达，100 μg/L SDF-1促使CXCR4 mRNA表达水平进一步上调，且能被1 mg/L AMD3100阻断。SDF-1组细胞增殖活性(0.847±0.039)高于对照组(0.624±0.011)和SDF-1＋AMD3100混合组(0.607±0.016)，AMD3100组(0.456±0.032)低于对照组和SDF-1＋AMD3100混合组(F=108.030，P＜0.05)。Transwell小室迁移及侵袭实验中SDF-1组穿膜细胞数(个：98.7±5.8、33.7±6.2)均多于对照组(21.0±2.2、6.1±2.3)、SDF-1＋AMD3100混合组(18.5±8.4、8.5±2.8)和AMD3100组(12.1±3.2、2.1±1.0)，后3组间比较差异无统计学意义。结论SDF-1/CXCR4生物轴可促进大肠癌细胞SW480的增殖、迁移及侵袭。

肠肿瘤；大肠；趋化因子CXCL12；受体,CXCR4；细胞增殖；细胞运动；细胞迁移；细胞侵袭；AMD3100

大肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，发病率在我国恶性肿瘤中居4～5位。随着人们生活环境、生活方式以及饮食结构的改变，大肠癌发病率呈上升趋势[1]。虽可采取手术、放化疗、免疫等综合治疗措施，但其5年生存率依旧不高。研究大肠癌发生、发展的分子机制并进行早期干预，对提高大肠癌临床治疗效果具有重要意义。研究显示基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)及其特异性受体 CXC趋化因子受体 4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)在乳腺癌、肺癌和甲状腺癌等多种肿瘤生长、侵袭和转移中起重要作用[2]。本课题组前期研究已证实大肠癌组织高表达CXCR4，其对大肠癌的发生以及浸润转移具有重要意义[3]，但有关其在大肠癌细胞中的作用报道尚少。本实验选取大肠癌细胞株SW480作为研究对象，探讨外源性SDF-1以及CXCR4特异性拮抗剂AMD3100干预后，大肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭能力的改变，以揭示SDF-1/CXCR4轴在大肠癌细胞生物学活性中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料、主要试剂与来源人大肠癌细胞株SW480(北京协和细胞资源中心)，DMEM高糖培养基、胎牛血清、Transwell小室(美国Corning公司，小室膜孔径为8.0 μm)，重组人SDF-1α(美国Peprotech公司，300-28A)，兔抗人CXCR4多克隆抗体(美国ABGENT公司，AT1696a-2F1)，AMD3100干粉(美国Sigma公司，A5602)，Matrigel胶(美国BD公司)，GAPDH 及CXCR4引物、RT-PCR试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养大肠癌细胞株SW480用DMEM培养基、10％胎牛血清在37℃、5％CO2、相对湿度90％的培养箱中培养，细胞贴壁生长，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 免疫组化法检测大肠癌细胞株SW480中CXCR4蛋白的表达在6孔板中制备细胞爬片，细胞均匀爬满玻片后行免疫组化染色：（1）无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次。（2）4％多聚甲醛在4℃条件下固定30 min。（3）3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶15 min。（4）0.5％Triton孵育20 min后，加兔抗人CXCR4抗体37℃60 min。（5）二抗工作液37℃孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)液显色，苏木素复染后自来水返蓝，显微镜下计数5个高倍视野中的阳性细胞数和总细胞数，阳性率=(阳性细胞数/总细胞数)×100％。

1.2.3 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测SDF-1以及AMD3100作用前后大肠癌细胞SW480中CXCR4 mRNA的表达采用完全随机法将细胞分成4组：对照组（未经任何处理）、SDF-1组（加入100 μg/L SDF-1）、SDF-1＋AMD3100混合组(先向细胞中加入1 mg/L AMD3100，孵育2 h后加入100 μg/L SDF-1)、AMD3100组（加入1 mg/L AMD3100）。提取各组总RNA，取相同浓度进行逆转录合成cDNA，并扩增，以GAPDH为内参。CXCR4、GAPDH基因序列引物：CXCR4正义链5′-TGGCCTTATCCTGCCTGCCTGGTAT-3′，反义链5′-GGAGTCGATGCTGATCCCAAT-3′，扩增片段大小为173 bp；GAPDH正义链5′-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′，反义链5′-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3′，扩增片段大小为104 bp。电泳后凝胶成像系统成像，测定各条带灰度值并进行统计分析。实验重复3次。

1.2.4 甲基噻唑基四唑（MTT）法检测SDF-1以及AMD3100对大肠癌细胞SW480增殖活性的影响将100 μL浓度为3×104个/mL SW480细胞单细胞悬液加入96孔板，24 h后细胞贴壁。按分组加药后孵育24 h，继而向各孔分别加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，37℃继续孵育4 h，弃除上清液。每孔加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)，于脱色摇床震荡10 min。酶标仪490 nm波长处测各孔光密度(OD)值。

1.2.5 Transwell迁移实验检测SDF-1以及AMD3100对大肠癌细胞SW480体外迁移能力的影响将SW480细胞用含5％胎牛血清的培养液制成浓度为5×105个/mL的单细胞悬液，取100 μL接种于Transwell小室的上室。向下室加入0.6 mL含10％胎牛血清的DMEM培养液，再向各实验组下室分别加入SDF-1和AMD3100，每组均设3个复孔。在37℃、5％CO2的培养箱中培养18 h后，用棉签擦去膜上方表面的细胞，用4％多聚甲醛固定下室面细胞后进行结晶紫染色，显微镜(×200)下分别计数5个不同视野，取均数。

1.2.6 Transwell侵袭实验检测SDF-1以及AMD3100对大肠癌细胞SW480体外侵袭能力的影响用50 mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室的上室面，室温风干，其他操作步骤同迁移实验。在37℃、5％CO2的培养箱中培养24 h后，用棉签擦去膜上方表面的细胞和基质胶，用4％多聚甲醛固定下室面细胞后进行结晶紫染色，显微镜(×200)下计数5个不同视野，取均数。

1.3 统计学方法数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠癌细胞SW480免疫组化结果 SW480细胞胞膜和胞浆均着色，CXCR4蛋白阳性率为80％。见图1。

2.2 SDF-1及AMD3100作用前后SW480细胞中CXCR4 mRNA表达水平 4组条带所测得灰度值由高到低依次为：SDF-1组(1.652±0.046)、对照组(1.358±0.065)、SDF-1＋AMD3100混合组(0.937± 0.064)、AMD3100组(0.492±0.060)，组间多重比较差异均有统计学意义(F=218.942，P＜0.01)。见图2。

2.3 SDF-1以及AMD3100作用下SW480细胞增殖活性的变化各组OD值差异有统计学意义（F= 108.030，P＜0.05），其中SDF-1组(0.847±0.039)高于对照组(0.624±0.011)和SDF-1＋AMD3100混合组(0.607±0.016)，AMD3100组(0.456±0.032)低于对照组和SDF-1＋AMD3100混合组（均P＜0.05）；SDF-1＋AMD3100混合组与对照组差异无统计学意义。

2.4 SDF-1以及AMD3100作用下SW480细胞迁移及细胞侵袭能力的变化 SDF-1组迁移细胞数均高于对照组、SDF-1＋AMD3100混合组和AMD3100组（均P＜0.05），后3组间比较差异均无统计学意义。SDF-1组穿过Matrigel胶的SW480细胞数均高于对照组、SDF-1＋AMD3100混合组和AMD3100组（均P＜0.05），后3组间比较差异均无统计学意义,见表1。

Fig.1 CXCR4 positive expression by immunohistochemistry in SW480 cells(×200)图1 SW480细胞CXCR4免疫组化阳性染色(×200)

Fig.2 The expression of CXCR4 mRNA in colorectal cancer cell line SW480 detected by RT-PCR图2 RT-PCR检测大肠癌细胞SW480 CXCR4 mRNA的表达

Tab.1 Changes of migration and invasion ability of SW480 colorectal cancer cells before and after SDF-1 and AMD3100 treatment表1 SDF-1及AMD3100作用前后SW480细胞迁移及侵袭能力的变化 (n=3,个,±s)

＊＊P＜0.01；a与SDF-1组比较，P＜0.05

组别对照组SDF-1组SDF-1＋AMD3100混合组AMD3100组F迁移细胞数21.0±2.2a98.7±5.8 18.5±8.4a12.1±3.2a169.076＊＊侵袭细胞数6.1±2.3a33.7±6.2 8.5±2.8a2.1±1.0a46.539＊＊

3 讨论

SDF-1又称趋化因子CXCL12，是一种广泛表达于多种组织的趋化因子。CXCR4是高度保守的G蛋白偶联的7次跨膜受体，作为SDF-1的特异性受体，其与SDF-1具有高度亲和性，两者特异性结合形成SDF-1/CXCR4轴是其生物学功能实现的分子基础，与细胞间信号转导、细胞增殖及细胞迁移侵袭等密切相关[4]。目前越来越多的研究致力于揭示SDF-1/CXCR4轴对肿瘤细胞生物学行为，特别是其对恶性细胞的增殖、分化、定向迁移和侵袭方面的影响。AMD3100是CXCR4特异性受体阻滞剂，通过与CXCR4竞争结合位点，有效阻断SDF-1结合CXCR4，从而抑制SDF-1/CXCR4轴在肿瘤生长、浸润及转移中的作用。1 mg/L的AMD3100是阻止人类免疫缺陷病毒（HIV）进入细胞的最佳浓度[5]，本研究以此浓度作为干预浓度。趋化因子受体常以一种独特的、非随机的方式存在于肿瘤细胞的细胞膜及细胞浆，如大肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等[6-7]。本研究结果显示SW480细胞中存在CXCR4蛋白以及CXCR4 mRNA的表达，表明SW480细胞表达CXCR4，可以此细胞株作为研究对象进行后续实验。外源性趋化因子SDF-1能够从基因水平进一步提高CXCR4 mRNA的表达，这一过程可被CXCR4特异性拮抗剂AMD3100削弱。这与本课题组前期对大肠癌组织的研究结[2]以及耿华等[8]对肺癌的研究结果相一致。

有研究发现线粒体释放的细胞色素c是半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)重要的激活剂，SDF-1 与CXCR4特异性结合形成的SDF-1/CXCR4轴可激活PI3K/Akt信号通路以及MAPK/ERK1/2信号通路，促使抗凋亡基因BCL-2表达上调，抑制细胞色素c从线粒体释放，从而阻断caspase-3依赖的细胞凋亡途径，无法正常发挥杀瘤效应[9]；趋化因子SDF-1与受体CXCR4特异性结合可使G蛋白偶联结构发生改变，激活蛋白激酶B(PKB)，诱导促凋亡蛋白BDA磷酸化失活[10]；随着肿瘤演进，免疫系统最初的免疫监视常被诱导成免疫耐受，免疫系统不能正常发挥捍卫作用[11]。有研究称SDF-1在浓度为100～1 000 μg/L时显现出最佳的刺激单核细胞、淋巴细胞、内皮及肿瘤细胞增殖、迁移的效果[12]。本研究选用100 μg/L SDF-1作为诱导浓度，实验证实100 μg/L SDF-1组细胞增殖活性较对照组明显增强，而CXCR4特异性拮抗剂AMD3100又能削弱这一过程，提示CXCR4参与了SDF-1促进SW480细胞增殖的过程，SDF-1/CXCR4轴在SW480细胞增殖中发挥重要作用。这与Shen等[13]对胰腺癌的研究结果一致。

本研究的Transwell迁移、侵袭实验结果显示SDF-1组发生迁移、侵袭的细胞数均高于对照组、SDF-1＋AMD3100混合组和AMD3100组，提示100 μg/L SDF-1可促进SW480细胞迁移、侵袭，这一过程又可被1 mg/L AMD3100阻断。而单独加入1 mg/L AMD3100、或按照100 μg/L SDF-1＋1 mg/L AMD3100混合组加药，均不能抑制SW480细胞的迁移、侵袭。季世强等[14]对胰腺癌的体外研究显示100 μg/L、1 mg/L AMD3100均可抑制胰腺癌细胞SW1990的迁移及侵袭，此结果与本实验结果存在差异，可能是由于细胞种类、细胞不同代以及细胞密度之间的差异造成。SDF-1/CXCR4生物轴影响肿瘤细胞迁移和侵袭的机制涉及调控肿瘤细胞表面黏附分子的表达、通过上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达进而诱导血管生成，增加血管通透性[15]、上调乙酰肝素酶和基质金属蛋白酶（MMP）-9[16]等以降解细胞外基质、调整细胞内骨架系统增强肿瘤细胞的运动能力[17]等。体外研究证实SDF-1/CXCR4生物轴在大肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭过程中发挥至关重要的作用。SDF-1/CXCR4轴在体内的作用情况有待进一步研究。

[1]Brenner H,Kloor M,Pox CP.Colorectal cancer[J].Lancet,2014,383 (9927):1490-1502.

[2]Teicher BA,Fricker SP.CXCL12(SDF-1)/CXCR4 pathway in cancer [J].Clin Cancer Res,2010,16(11):2927-2931.doi:10.1158/1078-0432.CCR-09-2329.

[3]Zheng SF,Zhan XH,Shi LF,et al.Expression of SDF-1 and its receptor CXCR4 in colorectal adenocarcinoma and their clinical significances[J].J Clin Exp Pathol,2013,29(1):9-13.[郑淑芳,展晓红,时丽芳,等.大肠癌中SDF-1与CXCR4的表达及临床意义[J].临床与实验病理学杂志,2013,29(1):9-13.]

[4]Lombardi L,Tavano F,Morelli F,et al.Chemokine receptor CXCR4: role in gastrointestinal cancer[J].Crit Rev Oncol Hematol,2013,88 (3):696-705.doi:10.1016/j.critrevonc.2013.08.005.

[5]Ji KL,Liang Y,Yun S,et al.Inhibition of CXCR4 activity with AMD 3100 decreases invasion of human colorectal cancer cells in vitro[J]. World J Gastroenterol,2008,14(15):2308-2313.

[6]Guo Q,Wu XH,Lu YP,et al.Relationship between chemokine axis CXCL12-CXCR4 and epithelial ovarian cancer[J].Chin Med J, 2013,93(21):1677-1680.

[7]Wu PF,Lu ZP,Cai BB,et al.Role of CXCL12/CXCR4 signaling axis in pancreatic cancer[J].Chin Med J,2013,126(17):3371-3374.

[8]Geng H,Xu ML.A study on the expression of chemokine CXCL12/ CXCR4 in non-small cell lung cancer[J].Tianjin Med J,2012,40(3): 203-205.[耿华,徐美林.趋化因子CXCL12/CXCR4在非小细胞肺癌中的表达[J].天津医药,2012,40(3):203-205.]doi:10.3969/j. issn.0253-9896.2012.03.004.

[9]Chen G,Chen SM,Wang X,et al.Inhibition of chemokine(CXCX-C motif)ligand 12/chemokine(C-X-Cmotif)receptor 4 axis(CXCL12/ CXCR4)mediated cell migration by targeting mammalian target of rapamycin(mTOR)pathway in human gastric carcinoma cells[J].J Biol Chem,2012,287(15):12132-12141.

[10]Yamada S,Shimada M,Utsunomiya T,et al.CXC receptor 4 and stromal cell-derived factor 1 in primary tumors and liver metastases of colorectal cancer[J].J Surg Res,2014,187(1):107-112.

[11]Yuan LQ,Zheng SF.Research progress on the mechanisms of neoplasm infiltration and metastasis[J].Journal of Modern Oncology, 2014,22(9):2222-2224.[袁丽倩,郑淑芳.肿瘤浸润转移机制的研究进展[J].现代肿瘤医学,2014,22(9):2222-2224.]doi:10.3969/j. issn.1672-4992.2014.09.68.

[12]Wang L,Li CL,Yu WB,et al.Influence of CXCR4/SDF-1 axis on E-cadherin/β-catenin complex expression in HT29 colon cancer cells [J].World J Gastroenterol,2011,17(3):625-632.

[13]Shen B,Zheng MQ,Lu JW,et al.CXCL12-CXCR4 promotes proliferation and invasion of pancreatic cancer cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(9):5403-5408.

[14]Ji SQ,Yu PP,Zhang QY.Inhibition of proliferation and invasion of pancreatic cancer cells with AMD3100 in vitro[J].Journal of Hepatopancreatobiliary Surgery,2011,23(4):329-335.[季世强,余盼攀,张启瑜.AMD3100抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭的体外实验[J].肝胆胰外科杂志,2011,23(4):329-335.]

[15]Yu YC,Shi XY,Shu Z,et al.Stromal cell-derived factor-1(SDF-1)/ CXCR4 axis enhances cellular invasion in ovarian carcinoma cells via integrin β1 and β3 expressions[J].Oncol Res,2014,21（4）:217-225.

[16]Chen YQ,Yu YN.Expression of SDF-1,CXCR4,MMP-2 and MMP-9 in tissues of gastric carcinoma and their significances[J].J Clin Exp Pathol,2012,28(2):135-139.[陈友权,于燕妮.胃癌中SDF-1、CXCR4、MMP-2和MMP-9的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志,2012,28(2):135-139.]

[17]Heckmann D,Maier P,Lanfs S,et al.CXCR4 expression and treatment with SDF-1α or plerixafor modulate proliferation and chemosensitivity of colon cancer cells[J].Transl Oncol,2013,6(2):124-132.

（2014-07-15收稿 2014-09-17修回）

（本文编辑陈丽洁）

Effects and Significance of SDF-1/CXCR4 in Proliferation,Migration and Invasion of Colorectal Cancer Cell Line SW480

YUAN Liqian1,ZHENG Shufang2△
1 Postgraduate Training Basement，2 Department of Pathology,Affiliated Hospital of Logistics College of CAPF,Liaoning Medical College,Jinzhou 300162,China
△

E-mail:zhengshf@126.com

ObjectiveTo discuss the influence and significance of stromal cell-derived factor 1(SDF-1)and its specific receptor CXC chemokine receptor 4(CXCR4)in proliferation,migration and invasion ability of SW480 colorectal cancer cells.MethodsThe colorectal cancer cell line SW480 in logarithmic phase was divided into four groups:control group(with no any processing),SDF-1 group(added 100 μg/L SDF-1),SDF-1＋1 mg/L AMD3100 mixed group(added 1 mg/L AMD3100 for 2 hours,then added 100 μg/L SDF-1)and AMD3100 group(added 1 mg/L AMD3100).Immunohistochemistry method was used to detect the protein expression of CXCR4 in SW480 cells.The expression of CXCR4 mRNA in SW480 cells was detected by RT-PCR before and after SDF-1 and AMD3100 treatment.MTT assay and transwell chamber were used to test the changes of proliferation,migration and invasion ability of SW480 cells before and after SDF-1 and AMD3100 treatment.ResultsThe result of immunohistochemistry showed that CXCR4 protein was expressed in SW480 cells(positive rate=80％).CXCR4 mRNA was expressed in SW480 cells.The expression of CXCR4 mRNA was up-regulated by SDF-1(100 μg/L),which could be inhibited by AMD3100(1 mg/L).The proliferation activity was higher in SDF-1 group(0.847±0.039)compared to that in control group(0.624±0.011)and SDF-1＋AMD3100 mixed group(0.607±0.016). The proliferation activity was lower in AMD3100 group(0.456±0.031)than that in control group and SDF-1＋AMD3100 mixed group(F=108.03,P＜0.05).The number of transmembrane cells was more in SDF-1 group(98.7±5.8,33.7±6.2)than that in control group(21.0±2.2,6.1±2.3),SDF-1＋1 mg/L AMD3100 mixed group(18.5±8.4,8.5±2.8)and AMD3100 group (12.1±3.2,2.1±1.0)detected by transwell chamber experiment.However,there were no statistical differences between three groups.ConclusionThe biological axis SDF-1/CXCR4 can promote the proliferation,migration and invasion in colorectal cancer cell line SW480.

intestinal neoplasms;intestine,large;chemokine CXCL12;receptors,CXCR4;cell proliferation;cell movement;cell migration;cell invasion;AMD3100

R735.34

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.002

天津市应用基础及前沿技术研究计划面上项目（11JCYBJC13000）；武警后勤学院面上项目（WYMZ201009）

1辽宁医学院武警后勤学院附属医院研究生培养基地（邮编300162）；2病理科

△通讯作者 E-mail：zhengshf@126.com