MCP-1转染人脐静脉内皮细胞过表达/沉默后相关信号通路研究

宋 恩 李光第 周如丹 赵学凌

细胞与分子生物学

MCP-1转染人脐静脉内皮细胞过表达/沉默后相关信号通路研究

宋 恩 李光第 周如丹 赵学凌△

目的 探讨单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）转染人脐静脉内皮细胞过表达/沉默后相关信号通路与深静脉血栓形成的关系。方法培养人脐静脉内皮细胞行免疫荧光、免疫共沉淀检测，构建人MCP-1细胞系过表达/沉默载体，基因表达谱芯片检测人MCP-1细胞系过表达/沉默后转录谱变化并行生物信息技术分析。结果培养人脐静脉内皮细胞；构建人MCP-1过表达/干扰载体MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP shRNAmir1经病毒转染后感染HUVECs；基因芯片检测发现与正常细胞相比，过表达载体MCP-1-pCDH-GFP转染细胞有18条信号通路下调，7条信号通路上调；干扰载体MCP-1-LMP shRNAmir1转染细胞有60条信号通路下调，15条信号通路上调。结论MCP-1转染人脐静脉内皮细胞后相关信号通路为深静脉血栓疾病分子层面研究提供新的思路，MCP-1可能在深静脉血栓形成发生发展过程中发挥重要作用。

单核细胞；趋化因子类；内皮，血管；脐静脉；信号传导；静脉血栓形成；单核细胞趋化蛋白-1；人脐静脉内皮细胞

单核细胞趋化蛋白（MCP）属于趋化因子家族CC亚族成员，该亚族主要由活化T细胞产生。MCP包括MCP-l、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5[1]。MCP-l主要由内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等分泌与释放。MCP-1具有诱导单核巨噬细胞趋化和激活单核巨噬细胞的双重作用[2]。MCP-l是炎症反应的始动因子，通过诱导、调节其他炎性介质的产生和释放，形成级联反应，介导炎症反应的进展。MCP-1参与动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病炎症反应过程[3]。深静脉血栓形成（deep venous thrombosis, DVT）是一种血液在深静脉内异常凝结导致的静脉回流障碍性疾病，DVT的病理生理过程包括血管壁损伤、血流淤滞、血液高凝状态、炎症反应等，其中炎症反应对DVT的发生发展起到重要作用[4]。目前已有研究表明，在DVT形成过程中，MCP-1协同白细胞介素（IL）-6等炎性因子也发挥重要作用[5]。本实验针对MCP-1在细胞层面进行研究，通过生物信息学分析，探索其相关信号通路的变化。

1 材料与方法

1.1 材料 过表达慢病毒载体及shRNA逆转录病毒载体购于Ambion公司；转染试剂购于QIAGEN公司；TRIzol、荧光定量引物、二抗IgG-HRP购于Invitrogen公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购于Fermentas公司；琼脂糖凝胶电泳检测购于OMEGA公司；PVDF膜购于Millipore公司；一抗购于Santan和康为公司；Real-time PCR用96孔板及膜、ECL显色试剂盒购于Bio-Rad公司；离心管、枪尖、PCR管购于Axygen公司；X线片购于柯达公司；HUVECs细胞原代及传代培养耗材购于Corning公司。

1.2 脐静脉内皮细胞培养，免疫荧光及免疫共沉淀检测 原代人脐静脉内皮细胞培养，制作细胞爬片，分别以抗人MCP-1抗体孵育，FITC标记二抗与之结合，激光共聚焦拍照观察蛋白在细胞中的定位，设置3次平行实验。培养人血管内皮细胞，收集、裂解细胞，以抗人MCP-1抗体进行IP反应，在反应中加入Protein A+G Agarose吸附MCP-1抗体，离心收集磁珠/抗体/蛋白复合物，将复合物进行SDS-PAGE分析，以银染显色，分离的条带挖胶进行质谱分析。

1.3 人MCP-1基因慢病毒过表达载体构建 通过GenBank数据库搜索人MCP-1基因完整CDS序列，用BLAST分析寻找特异性设计引物，引物设计软件为primer 5.0，上游5′-GCAAGCTTATGCCTTGTGTTCAGGCG-3′，下游5′-GCCTCGAGTTAGAAAGGTAAGGTGTC-3′，产物长度300 bp。行PCR反应，条件如下：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30次循环，72℃延伸10 min。对人MCP-1基因进行扩增，退火温度为58℃，通过进行胶回收行琼脂糖凝胶电泳检测；将收集胶回收的目的片段和质粒载体进行连接，以pCDH-GFP为测序引物进行测序。

1.4 人MCP-1基因逆转录病毒干扰载体构建 人MCP-1基因逆转录病毒Oligo片段扩增，利用Oligoengine在线软件设计2条22个碱基的候选siRNA靶序列。miR30FWD(Xho Ⅰ)：5′-CAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGT-3′，miR30REV(EcoRⅠ)：5′-CTAAAGTAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCA-3′，筛选出G+C含量小于50％，且与哺乳动物的其他基因没有同源性的最优siRNA靶序列，再根据MSCV-LMP逆转录病毒载体的特点，设计出相应的具有发夹结构的shRNA模板。将合成的Oligo片段稀释后，退火温度52℃，条件如下：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30次循环，72℃延伸10 min。进行PCR反应。干扰片段扩增后，行琼脂糖凝胶电泳检测。把胶回收的目的片段和质粒载体进行连接，以LMP为测序引物进行测序。

1.5 过表达/干扰载体病毒包装、感染 病毒宿主细胞为293T细胞，HUVECs为感染细胞。pCDH-GFP(12 μg)的包装质粒为pCL-ECO，用量8 μg；转染人MCP-1-pCDH-GFP过表达质粒，MSCV-LMP(12.5 μg)包装质粒分别是：pAPAX(7.5 μg)、pMD2.G(5 μg)；分别转染人MCP-1-LMP shRNAmir1、2质粒，总时间感染48～72 h后，为检测所构建干扰载体是否能有效上调和下调目的基因表达，将构建质粒分组转染细胞。检测MCP-1 mRNA实验部分分为过表达实验及干扰实验，在过表达实验中设置：正常组（正常细胞）、空白组（转染空载体细胞）、过表达组；在干扰实验中设置：正常组（正常细胞）、空白组（转染空载体细胞）、干扰1组、干扰2组。检测MCP-1蛋白水平实验中，设置：正常组（正常细胞）、过表达组、干扰1组、干扰2组。

1.6 Real-time PCR测定人MCP-1 mRNA水平 TRIzol抽提细胞总RNA；依据RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒标准操作进行cDNA合成。SYBR荧光定量PCR引物设计，引物设计软件为primer 5.0，人MCP-1上游引物5′-CAAGCAGAAGTGGGTTCAGGATT-3′，下游引物5′-TCTTGGGTTGTGGAGTGAGTGTTC-3′，产物长度89 bp。βactin上游引物5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-GACGCCAGTAGACTCCACGACA-3′，产物长度180 bp。Real-time反应两步法条件如下：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火/延伸60 s，共40次循环。实验依据Maxima®SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×)（Fermentas）操作。结果的参数主要是观察熔解曲线和扩增曲线，用软件DataAssist™v3.0 Software（ABI）以2-ΔΔCt方法来对结果进行分析。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。

1.7 人MCP-1蛋白水平测定 实验细胞总蛋白提取：收集各组HUVECs后添加Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF) （Sigma）的RIPA裂解液（Beyotime），冰浴30 min；4℃12 000 r/min离心5 min；取上清，再用BCA法测定计算蛋白浓度。蛋白免疫印迹法（Western Blot）分析目标蛋白的表达情况：将电泳分离后的细胞总蛋白质从凝胶转移到固相支持物PVDF膜上，然后以特异性抗体(一抗MCP-1/β-actin，兔抗人，1∶1 000)检测目标蛋白的表达情况，Bio-Rad膜成像系统下显色成像并用Quantity One软件对比分析。

1.8 人MCP-1细胞系过表达/沉默后转录谱变化 按前文转染步骤进行实验，将收获转染了人的MCP-1-LMP shRNAmir1、MCP-1-pCDH-GFP过表达的细胞和转染空载体细胞作为对照，提取总RNA，分组为（1）正常组细胞。（2）MCP-1-pCDH-GFP转染细胞。（3）MCP-1-LMP shRNAmir1转染细胞。进行基因表达谱芯片分析，每样品1张芯片，共3个基因芯片；样本送至上海康成生物工程有限公司进行基因芯片检测。

1.9 统计学方法 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件完成。计量资料采用均数±标准差（±s）表示；比较组间数据采用单因素方差分析；组间两两比较采用Tukey及Scheffe法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人MCP-1基因慢病毒过表达载体、逆转录病毒干扰载体构建 慢病毒过表达载体构建，PCR扩增人MCP-1目的基因，琼脂糖电泳清晰可见单一的目的条带；本研究选取慢病毒载体pCDH-GFP中，EcoRⅠ和BamHⅠ两个酶切位点来连接载体与目的基因，见图1。依据逆转录病毒载体LMP质粒载体特点，固定选取XhoⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点来进行连接，构建逆转录病毒干扰载体。扩增人MCP-1-LMP shRNAmir1、2干扰载体，条带在 985 bp/ 7 019 bp表明已插入目的条带，属于阳性克隆。每个载体挑取2个克隆，进行初步的酶切鉴定，见图2。

Fig.1 Electrophoresis result of human MCP-1 PCR products and pCDH-GFP plasmid profile图1 人MCP-1PCR产物电泳检测及pCDH-GFP质粒图谱

Fig.2 H MCP-1 carrier enzyme identification and LMP lentiviral vector图2 载体酶切鉴定图谱及慢病毒载体LMP质粒图谱

2.2 过表达及抑制效率检测 检测MCP-1 mRNA过表达实验中，过表达组（5.365±0.752）较正常组（1.007±0.276）及空白组（1.223±0.426）mRNA表达明显上调（F=65.895，P＜0.05），正常组及空白组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。检测MCP-1 mRNA干扰实验中，干扰1组mRNA表达（0.052±0.019）较正常组（1.004±0.161）、空白组（0.998±0.206）及干扰2组（0.968±0.306）表达明显下调（F=16.169，P＜0.05）。检测MCP-1蛋白水平实验中，正常组、过表达组及干扰1、2组Ratio值分别为：0.62、0.84、0.24、0.56，过表达组蛋白水平较正常组明显上调，干扰1组较正常组及干扰2组明显下调，见图3。

Fig.3 Results of Western blot analysis for protein expressions of human MCP-1图3 Western blot检测人MCP-1蛋白表达水平结果

2.3 人MCP-1细胞系过表达/沉默后转录谱的变化 MCP-1-pCDH-GFP过表达载体、MCP-1-LMP shRNAmir1干扰载体进行细胞转染，收获正常组细胞（转染空载体细胞）；MCP-1-pCDH-GFP转染细胞；MCP-1-LMP shRNAmir1转染细胞，行基因芯片检测，基因芯片检测到的所有表达变化的基因热谱图，其中红色表示相对高表达，绿色代表相对低表达，见图4。基因芯片检测结果根据KEGG Pathway分析可见，与正常细胞相比，过表达载体MCP-1-pCDH-GFP转染细胞有18条信号通路下调，7条信号通路上调；干扰载体MCP-1-LMP shRNAmir1转染细胞有60条信号通路下调，15条信号通路上调，见图5～8。

Fig.4 Gene chip thermography图4 基因芯片热谱图

Fig.5 Compared with normal group,MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells showed 18 down-expressed signaling pathways图5 与正常细胞相比MCP-1-pCDH-GFP转染细胞18条信号通路下调

Fig.6 Compared with normal group,MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells showed 7 up-expressed signaling pathways图6 与正常细胞相比MCP-1-pCDH-GFP转染细胞7条信号通路上调

Fig.7 Compared with normal group,MCP-1-LMP shRNAmir1-transfected cells showed 60 down-expressed signaling pathways图7 与正常细胞相比MCP-1-LMP shRNAmir1转染细胞60条信号通路下调

Fig.8 Compared with normal group,MCP-1-LMP shRNAmir1-transfected cells showed 15 up-expressed signaling pathways图8 与正常细胞相比MCP-1-LMP shRNAmir1转染细胞15条信号通路上调

3 讨论

静脉血栓栓塞(VTE)是一种多原因引起的，多基因相关的疾病，包括DVT和肺动脉栓塞(PE)。在西方国家DVT和PE的发病率分别约为0.93％和0.05％，外科手术后行抗凝治疗的患者，DVT的发生率为9.6％[6]。19世纪，Virchow提出静脉血栓形成的三联病因：静脉壁损伤、血流滞缓和血液高凝状态的致栓学说，但内涵已从早期的病理解剖深化到现代的分子水平机制研究[7]。根据现阶段对DVT形成机制的研究，参与DVT形成的关键角色有：血管内皮细胞、血小板、胶原、炎性因子、血流动力学等，各因素间彼此相互影响，导致静脉内环境中凝血/抗凝、纤溶/抗纤溶系统的动态平衡打破，最终导致血栓形成[8]。但现阶段只了解DVT部分形成机制，近年来随着对血栓疾病不断深入研究，尚有很多未被发现的因素直接或间接地影响血栓形成的关键环节，调控血栓形成。而针对DVT形成的分子机制，已发现有大量的基因、蛋白在血栓形成过程中起到重要作用，并且部分在动脉血栓等心血管疾病中得到证实[9-10]。

趋化因子的重要成员MCP-1是一种碱性蛋白，为76个氨基酸残基构成的蛋白单链。MCP-1的受体 CC趋化因子受体 2(CC chemokine receptor 2，CCR2)是一类含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体，位于3号染色体上，在各种细胞类型上都有发现，包括嗜碱性粒细胞、单核细胞、自然杀伤细胞和T细胞。MCP-1与CCR2结合后，受体变构并与G蛋白结合，激活磷酸肌醇等信号转导通路发挥生物学作用[11]。目前在心血管疾病中MCP-1的研究较广泛。Park等[12]也发现在急性心肌梗死的早期阶段，形成良好侧支循环的患者比没有形成侧支循环的患者血浆中MCP-I的水平明显增加，表明MCP-l的过度表达在急性心肌梗死的早期阶段对侧支循环的形成有重要意义，可能为早期急性心肌梗死的治疗提供新的途径。宋军锋等[13]研究发现，急性冠脉综合征患者的MCP-1水平较稳定型心绞痛和正常对照组患者增高，证实MCP-l是动脉粥样硬化和斑块不稳定的指标，且MCP-l水平与冠脉侧支形成呈正相关。许政等[14]构建兔右颈总动脉瘤模型，研究发现在模型脑动脉瘤壁中有大量的MCP-1的表达，表达细胞主要为平滑肌细胞和血管内皮细胞，提示动脉瘤壁的组成细胞能不断产生趋化因子，趋化单核细胞，加强炎性反应。提示了在脑动脉瘤发病过程中，MCP-1基因作为早期表达基因，其表达产物诱导了单核巨噬细胞在动脉壁的黏附，进一步使动脉壁弹力纤维降解，促进了脑动脉瘤的发生、发展。现已证明，动脉粥样硬化(Atheroselerosis，As)是一种慢性炎症性疾病，细胞因子在As的各个阶段中发挥着重要的调节作用，MCP-l是与As具有密切关系的细胞因子之一[14]。Kawanami等[15]发现Rho-kinase可激活凝血酶，通过p38MAPK/NF-κB信号通路，使MCP-l表达上调。Lin等[16]发现MCP-l对单核细胞与血管内皮细胞黏附方面起到重要作用。但目前MCP-l在DVT形成过程中的具体机制尚未阐明。

本实验通过培养人脐静脉内皮细胞，构建人MCP-1过表达/干扰载体MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP shRNAmir1经病毒转染后感染HUVECs，应用基因芯片检测发现与正常细胞相比，过表达载体MCP-1-pCDH-GFP转染细胞有18条信号通路下调，7条信号通路上调；干扰载体MCP-1-LMP shRNAmir1转染细胞有60条信号通路下调，15条信号通路上调。

随着对MCP-1的生物学功能、基因定位和调节信号转导机制及相关信号通路的进一步认识，以及它对其他细胞因子和炎性细胞的调控的深入研究，探索如何对其中的某些环节进行干预，将为DVT分子机制的研究提供新思路。

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（2014-05-26收稿 2014-08-07修回）

（本文编辑 魏杰）

The Study of Signaling Pathways in MCP-1 Over-Expression/Interference of HUVECs

SONG En,LI Guangdi,ZHOU Rudan,ZHAO Xueling△
Orthopedics Department of the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,China△

E-mail:zxldoctor@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the association between the signaling pathways of MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells and deep venous thrombosis(DVT).MethodsThe cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) were tested by immunofluorescence and co-immunoprecipitation methods.The constructed MCP-1 over-expression/interference vector,and the change of transcription profile were detected by microarray assay and biological information technology analysis.ResultsMCP-1 over-expression/interference vector MCP-1-pCDH-GFP/MCP-1-LMP shRNAmir1 was constructed and HUVECs were transfected.According to the microarray analysis we found that there were 18 down-expressed signaling pathways and 7 up-expressed signaling pathways in MCP-1-pCDH-GFP-transfected cells.There were 60 downexpressed signaling pathways and 15 up-expressed signaling pathways in the MCP-1-LMP shRNAmir1 transfected cells.ConclusionSignaling pathways of MCP-1 plays an important role in DVT formation，which may provide us a new way to study molecular mechanism of DVT.

monocytes;chemotactic factors;endothelium,vascular;umbilical veins;signal transduction;venous thrombosis;monocyte chemoattractant protein-1;human umbilical vein endothelial cells

R543

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.001

国家自然科学基金资助项目（801060151）；云南省卫生科技计划项目（2012ws0007）；云南省科技厅重点新产品开发计划项目（2010BC010）

昆明医科大学第一附属医院骨科（邮编650032）

△通讯作者 E-mail:zxldoctor@hotmail.com