异丙酚对内毒素诱导人单核细胞系THP-1细胞TREM-1表达的影响

陆立仁 张良清 卢 燕

异丙酚对内毒素诱导人单核细胞系THP-1细胞TREM-1表达的影响

陆立仁1张良清2△卢 燕2

目的 探讨异丙酚对内毒素诱导人单核细胞系THP-1细胞髓样细胞触发性受体-1（TREM-1）表达的影响。方法培养THP-1细胞，分成7组，分别对应：Control组，单纯无血清培养基培养；内毒素（LPS）组，单纯LPS 100 μg/L刺激；Pro组，单纯加入异丙酚100 μmol/L；P1组，LPS+异丙酚12.5 μmol/L；P2组，LPS+异丙酚25 μmol/L；P3组，LPS+异丙酚50 μmol/L；P4组，LPS+异丙酚100 μmol/L。观察16 h后收集细胞培养上清液采用ELISA测定肿瘤坏死因子（TNF）-α水平；收集细胞采用流式细胞术检测TREM-1蛋白表达水平；收集细胞采用实时定量PCR检测TREM-1 mRNA表达水平。结果与LPS组相比，P3组与P4组的细胞表面TREM-1蛋白表达水平明显增高（P＜0.05），细胞上清液中TNF-α水平明显下降（P＜0.05）；与Control组比较，LPS组TREM-1 mRNA表达明显增加（P＜0.05）；与LPS组比较，P4组细胞TREM-1 mRNA表达水平降低（P＜0.05）。结论异丙酚可使LPS诱导的THP-1细胞表面TREM-1蛋白表达水平增加，细胞TNF-α的释放减少，TREM-1 mRNA的表达量下降。

内毒素类；脂多糖类；二异丙酚；单核细胞；肿瘤坏死因子α；髓样细胞触发受体1

脓毒症是由感染引起的全身性炎症反应综合征（SIRS），有细菌或可疑感染灶存在，是由于机体炎症反应过度或炎症失控所致。髓样细胞触发性受体-1 （TREM-1）是近年发现的表达于髓样细胞的免疫球蛋白超家族活化受体，可与内毒素（LPS）协同诱导单核细胞促炎细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1的分泌[1]。近年来逐步证实TREM-1可能触发并扩大炎症反应，是介导脓毒性休克的关键介质，在脓毒症的发生发展中起到重要作用[2]。异丙酚是一种新型非巴比妥类静脉麻醉药，具有良好的抗氧化作用和抑制细胞因子合成与释放的功能，它以诱导苏醒迅速，对心肺功能影响小而在临床上应用广泛。本研究通过观察异丙酚的浓度变化对细胞TREM-1蛋白、mRNA表达以及促炎因子水平的影响，以期探讨异丙酚抑制炎性反应的位点及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人单核细胞系THP-1由南方医科大学病理生理教研室惠赠。LPS from E.coli 055:B5(L 2880)购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；人TNF-α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒、Human TREM-1 Phycoerythrin MAb(FAB1278P)、Mouse IgG1 Phycoerythrin Isotype Control（IC002P）均购自美国R＆D公司；PrimeScript RT reagent kit、Sybr primescript RT-PCR kit购自日本TaKaRa公司；引物由广州Invitrogen公司合成。

1.2 细胞培养与分组 在37℃，5％CO2的培养箱中，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养THP-1细胞，行台盼蓝染色后证实存活率达到95％以上。离心收集THP-1细胞，用无血清RPMI-1640培养基洗涤3次后，用无血清RPMI-1640培养基重悬细胞，调节细胞浓度到2.4×106/mL，向每孔加入2 mL细胞悬液，培养过夜。选取24孔培养板分成7组，分别对应：Control组，单纯无血清培养基培养；LPS组，单纯LPS 100 μg/L刺激；Pro组，单纯加入异丙酚100 μmol/L；P1组，LPS+异丙酚12.5 μmol/L；P2组，LPS+异丙酚25 μmol/L；P3组，LPS+异丙酚50 μmol/L；P4组，LPS+异丙酚100 μmol/L。观察规定的时间后收集细胞培养上清液-70℃保存，采用ELISA检测TNF-α水平；收集细胞采用流式细胞术（FACS）检测TREM-1蛋白表达水平；收集细胞采用实时定量PCR （qRT-PCR）检测TREM-1 mRNA表达水平。

1.3 FACS检测细胞表面TREM-1蛋白 收集细胞后离心1 500 r/min，5 min，Staining Buffer洗涤3次，调整细胞浓度为4× 106/mL。其中1管加入PE标记的大鼠IgG2A抗体作为同型对照，其余加入PE标记的human anti-TREM-1，2～8℃温度下孵育30～45 min，Staining Buffer洗涤2次后送流式细胞仪检测。

1.4 qRT-PCR检测定TREM-1 mRNA 引物设计参照Gen-Bank中的序列，由广州Invitrogen生物工程技术服务有限公司合成，TREM-1引物上游5′-CTGAAATCAACCTTACAAATGTGAC-3′，下游5′-GCTCTTACTCAGGAATCCACCA-3′，扩增长度92 bp；内参GAPDH引物上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，扩增长度93 bp。用Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录成cDNA时严格按照TaKaRa公司的PrimeScriptTM逆转录试剂盒操作说明进行。qRT-PCR反应严格按照TaKaRa公司的SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒操作说明进行；反应条件为：95℃5 min，95℃30 s，62℃15 s，72℃20 s，40个循环，72℃10 min。采用Corbett公司Rotor gene 3000分析系统，通过比较CT值法(2-ΔΔCT法)比较TREM-1相对与GAPDH持家基因的相对表达量。

1.5 ELISA测定上清液中TNF-α水平 将细胞培养上清液从-70℃冰箱取出后室温下解冻，然后按照人TNF-α ELISA试剂盒操作说明测定上清液中TNF-α水平。

1.6 统计学方法 采用SAS 8.1软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，均数间比较用单因素方差分析，组间多重比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各处理组TREM-1蛋白表达水平 与Control组相比，单纯LPS处理后，LPS组细胞表面TREM-1蛋白水平明显下降（P＜0.05），单纯异丙酚处理后，Pro组细胞表面TREM-1蛋白表达水平无明显变化（P＞0.05）。与LPS组相比，异丙酚与LPS共孵育处理下，P1组、P2组细胞表面TREM-1蛋白表达水平无明显差异（P＞0.05），P3组、P4组的细胞表面TREM-1蛋白水平则明显增高（P＜0.05），见图1、表1。

Fig.1 TREM-1-PE flow cytometry chart in each group图1 各处理组TREM-1流式细胞图

Tab.1 Comparison of observation in each group表1 各处理组细胞观察指标的比较(n=5,±s)

Tab.1 Comparison of observation in each group表1 各处理组细胞观察指标的比较(n=5,±s)

＊＊P＜0.01；a与Control组比较，b与LPS组比较，P＜0.05

组别Control组LPS组Pro组P1组P2组P3组P4组F TREM-1蛋白56.86±4.40 37.18±2.35a53.26±3.65b39.42±2.79a39.12±3.80a45.82±3.11b55.24±4.42b27.41＊＊TREM-1基因1±0 3.73±0.59a1.87±0.36b3.93±0.73a4.14±0.54a3.32±0.60a2.08±0.46b27.42＊＊TNF-α(ng/L) 109.87±9.34 190.35±15.68a105.27±7.83b202.30±19.27a190.33±18.25a126.85±11.25b113.25±7.06b52.37＊＊

2.2 各处理组TREM-1 mRNA表达水平 与LPS组比较，P4组细胞TREM-1 mRNA表达水平降低（P＜0.05）；与Control组比较，LPS组TREM-1表达明显增高（P＜0.05），见表1。

2.3 各处理组上清液中TNF-α水平 与Control组相比，LPS组、P1组、P2组细胞培养上清液中TNF-α水平明显增高（P＜0.05）。与LPS组比较，P3组、P4组细胞培养上清液中TNF-α水平明显降低（P＜0.05），见表1。

3 讨论

TREM-1是近来发现的中性粒细胞、单核/巨噬等髓样细胞上表达的表面分子，属于免疫球蛋白超家族成员[1]。多项研究证实其在炎症发生与级联放大效应中起重要作用，是介导脓毒症发生发展的关键分子。异丙酚具有良好的抗氧化作用和抑制细胞因子合成与释放的功能[3]。但异丙酚是否可通过影响TREM-1而起到抑制炎症反应及其之间的剂量关系尚少见报道。

本研究显示，THP-1细胞表面TREM-1一般情况下表达水平较高，而加入LPS后明显降低，与多项的研究发现相反[4-5]。但Wong-Baeza等[6]采用不同浓度LPS诱导人外周血单核细胞炎性反应，结果显示细胞表面TREM-1受体随着LPS浓度的增加而呈下调趋势，与本研究结果趋势相一致。而van Bremen 等[7]在严重脓毒血症患者中发现，TREM-1在单核细胞中表达升高，但在中性粒细胞中表达降低。Mazzucchelli等[8]在新生儿脓毒症中也发现TREM-1在多型核白细胞中表达降低，而CD64表达明显升高。但Mahdy等[9]用LPS诱导中性粒细胞炎性反应，发现细胞表面的TREM-1受体并未随着炎性反应的加强而呈现上调趋势。这可能是由于：（1）本研究所采用的THP-1细胞是一种前单核细胞，与外周血中的单核细胞表面受体表达种类可能存在有一定的差异，TREM-1可能参与细胞分化功能[10]，而Cai等[11]研究发现TREM-1在单核细胞凋亡过程中有重要作用。（2）TREM-1在LPS存在时表达下调也可能是TREM-1受体活性自我限制效应而使机体恢复稳态的一种保护机制[6]。因此，本研究可能提示TREM-1在不同的细胞中参与的反应或者在相互调节通路中所起到的作用并不完全相同。

目前的研究表明，异丙酚可明显降低血清中炎性因子水平，减弱单核细胞和中性粒细胞的功能，呈现剂量依赖性，从而降低死亡率[12]。本研究发现，单独异丙酚孵育THP-1细胞，细胞的状态与Control组无明显差异，异丙酚并不影响正常状态下的细胞功能[3]；与LPS组相比发现THP-1细胞中的TREM-1 mRNA在异丙酚孵育中表达量下降，上清液中TNF-α的浓度也降低，这再次证实了异丙酚可明显降低炎性因子水平，抑制炎性反应。与Mihailidou等[13]的研究相类似，其研究发现在U937单核细胞中，地塞米松可通过TNF-α介导降低TREM-1的基因表达水平。但Dimopoulou等[14]的研究却发现在严重脓毒血症患者中TREM-1的基因表达量在单核细胞并没有增加。与LPS组相比发现在异丙酚孵育的THP-1细胞中TREM-1 mRNA的表达量下降，而在THP-1细胞表面TREM-1的蛋白水平却增加，这可能是由于异丙酚与LPS共同孵育的情况下，THP-1细胞TREM-1蛋白的降解水平也明显降低，因而虽然TREM-1 mRNA指导TREM-1合成减少，但总趋势表现为TREM-1蛋白表达量的增加，但具体机制还有待进一步的研究。

综上，本研究初步证明异丙酚可使LPS诱导的THP-1细胞炎性反应中TNF-α水平降低，抑制TREM-1 mRNA的表达，但没有相应的抑制细胞表面TREM-1蛋白水平的表达，其确切的分子及生物学机制有待进一步研究。

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（2013-12-17收稿 2014-04-02修回）

（本文编辑 李国琪）

Effects of Propofol on Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1(TREM-1)by Lipopolysaccharide-Stimulated Human Monocyte Cell Lines

LU Liren1,ZHANG Liangqing2,LU Yan2
1 Department of Anesthesia,Nanhai Hospital Affiliated to Southern Medical University,Foshan 528000,China; 2 Department of Anesthesia,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College ZHANG Liangqing,E-mail:983275857@qq.com

ObjectiveTo evaluate the effects of propofol on TREM-1 expression in THP-1 cells stimulated by lipopolysaccharide(LPS).MethodsCells were divided into 7 groups:(1)control group;(2)LPS group that was exposed to LPS in final concentration of 100 μg/L;(3)Progroup that was incubated with 100 μmol/L propofol;(4-7)groups combined 100 μg/L LPS with propofol at different dose of 12.5 μmol/L(P1group),25 μmol/L(P2group),50 μmol/L(P3group),100 μmol/L(P4group)respectively.After 16 hours of incubation,the TNF-α concentration in supernatants were measured by ELISA.TREM-1 expression were examined by FACS and TREM-1 mRNA were detected using qRT-PCR.ResultsTREM-1 on THP-1 increased significantly in group P3and group P4compared with LPS group(P＜0.05).The concentrations of TNF-α in P3and P4(P＜0.05)decreased substantially in supernatant compared with LPS group.TREM-1 mRNA transcription level in group LPS rise considerably(P＜0.05)compared to that in control group,and it dropped greatly in group P4(P＜0.05)compared with that in group LPS.ConclusionPropofol could enhance TREM-1 expression on surface of THP-1 stimulated by LPS.Propofol reduces TNF-α level in culture supernatant.And propofol may restrain TREM-1 mRNA expression.

endotoxins;lipopolysaccharides;propofol;monocytes;tumor necrosis factor-alpha;triggering receptor expressed on myeloid cells 1

R364.5

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.08.007

1广东佛山，南方医科大学附属南海医院麻醉科(邮编528000)；2广东医学院附属医院麻醉科

△通讯作者 E-mail:983275857@qq.com