姜黄素对急性肺栓塞大鼠NF-κB影响的研究

张 微 王灵聪 浙江中医药大学第一临床医学院 杭州 310006

姜黄素对急性肺栓塞大鼠NF-κB影响的研究

张 微 王灵聪 浙江中医药大学第一临床医学院 杭州 310006

目的 研究姜黄素（CUR）对急性肺栓塞（APE）大鼠肺组织中核转录因子kappa B（NF-κB）的影响。方法 48只SD大鼠随机分成对照组、假手术组、模型组和CUR治疗组，每组12只。使用自体血栓复制的方法制备APE大鼠动物模型，栓塞后6、24h各组随机取大鼠6只，水合氯醛麻醉后分别取肺组织行病理检查：Western blot检测NF-κB表达水平，免疫组化染色检测NF-κB阳性细胞数。结果 肺组织病理证实典型APE的血栓和肺泡坏死出血，CUR能减轻肺组织的病理改变。免疫组化染色可见在肺泡细胞、支气管上皮细胞、支气管平滑肌以及巨噬细胞周围均有不同程度的NF-κB表达。栓塞后6、24h，CUR治疗组NF-κB阳性细胞计数显著低于模型组（P＜0.01），接近对照组和假手术组。栓塞后6、24h时，Western blot检测结果显示，CUR治疗组NF-κB蛋白表达水平低于模型组（P＜0.01），接近对照组及假手术组。结论 CUR可通过下调APE大鼠肺组织中NF-κB表达水平改善其肺部损害，这可能是其干预APE的作用机制之一。

大鼠；肺栓塞；姜黄素；NF-κB

急性肺栓塞（acute pulmonary embolism，APE）是由于内源性和外源性栓子堵塞肺动脉主干或分支引起肺循环障碍的临床和病理生理综合征，其病死率仅次于心肌梗死和肿瘤[1]。美国1979年—1999年住院患者中，肺栓塞（PE）的发病率为0.4%。美国每年有30万人死于APE，居死亡原因的第三位[2-4]。根据法国一项社区研究，PE的发生率为6.0/10 000[5]。大面积、亚大面积的肺栓塞预后较差，有报道称诊断后30天、1年和3年的病死率分别为13%、26%和35.3%[6]。在前期的研究中[7]，我们采用姜黄素（curcumine，CUR）治疗肺栓塞已取得一定的疗效。核转录因子Kappa B（NF-κB）在各类细胞中广泛存在，参与调控多种生理及病理过程，在未受刺激的情况下，以无活性的形式存在。目前对于APE后NF-κB的变化及CUR的干预作用的报道极少，本文观察经CUR干预后，APE大鼠肺组织NF-κB的表达情况及CUR的疗效，并研究其可能的作用机制。

1 实验材料

1.1动 物 SPF级雄性SD大鼠，购自无锡江南实验动物场，动物合格证号：SCXK（苏）2009-0005。

1.2药物和试剂 CUR由上海丽臣生物科技有限公司提供，规格20mg/支，批号110823。Western blot：NF-κB-P65抗体（ab7970）购于Abcam公司；β-Actin抗体（sc-47778）购于Santa Cruz公司；羊抗兔IgGHRP二抗（BS13278）购于Bioworld公司；羊抗小鼠IgG-HRP二抗（BS12478）购于Bioworld公司。免疫组化试剂：兔多克隆NF-κB抗体由Bioworld公司提供，配制成1:200工作液；SP免疫组化染色试剂盒，由福州迈新生物技术有限公司提供。

2 实验方法

2.1制备动物模型及CUR治疗 48只雄性成年SPF级SD大鼠（体质量约200g），根据IBM SPSS19.0统计软件得出的随机数表将大鼠分为正常对照组、假手术组、APE模型组和CUR治疗组，每组12只。采用自体血栓复制法[7-8]制备大鼠APE动物模型，具体方法：从大鼠自身眼眶静脉取血制成0.5mL血栓混悬液（约15～20个血栓）置于2mL注射针筒内，并迅速注入到右颈总静脉内，当大鼠明显发绀、呼吸加深加快，则表明APE造模成功[9]。正常对照组不予任何处理，假手术组则将等量生理盐水注入右颈总静脉内。手术前1天以及40min前分别对各组大鼠按设计进行灌胃：CUR治疗组给予CUR（浓度为100mg/kg）2mL，余各组予等量生理盐水。模型建立后6、24h，CUR治疗组给予2mL CUR（浓度同上）灌胃，正常对照组、假手术组和模型组均采用等量生理盐水灌胃。栓塞后6、24h分别从各组中随机各取6只大鼠，分别取肺组织检测各项指标。所有大鼠均在屏障环境下饲养，温度20～26℃，昼夜交替时间12h/ 12h，相对湿度40%～70%。实验期间，动物死亡率约20%，死亡的大鼠予补充。

2.2肺组织病理学检查 取大鼠肺组织用10%甲醛固定24h后用石蜡包埋切片，再行HE染色，最后由病理专科人员显微镜检查。

2.3Western blot[1]分析NF-κB蛋白表达 分取左肺上叶，将少量组织置于匀浆器中，剪碎。加入500μL含PMSF的单去污剂裂解液于匀浆器中匀浆，使组织碾碎。再将裂解液移于1.5mL离心管中，在4℃的温度下裂解30min，12 000rpm离心10min，取上清测定蛋白量，并于-70℃条件下保存。准备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，待测样品蛋白的加样量为40mg/20μL/孔，电压为100V，电泳分离。把分离出来的蛋白条带转到NC膜上，然后用含1.0%BSA的TBST封闭液封闭约1h。再加入稀释的NF-κB和β-Actin抗体，室温下孵育1h。洗膜后加入稀释的二抗，并温和振荡1h。化学发光显影，据Image J软件分析得到抗体与抗原相结合的NF-κB及β-actin特异性条带的光密度值，并计算出NF-κB与β-actin光密度的比值。

2.4免疫组化染色测定肺组织表达的NF-κB阳性细胞数 光镜下，每张肺片随机取3个不重叠的视野。每只大鼠各观察4张肺片计数阳性细胞，共得到12个数值，取平均值为一只大鼠的结果。

2.5统计学方法 数据以均数±标准差（）表示，使用SPSS19.0统计软件，采用随机区组设计的方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1各组大鼠肺组织病理 正常对照组与假手术组的肺组织无病理改变。模型组栓塞后6h见肺血栓、肺泡壁坏死和肺泡出血，有轻度至中度中性粒细胞及单核巨噬细胞浸润。CUR治疗组肺组织的病变较模型组减轻，肺泡壁轻至中度充血，伴轻度中性粒细胞及单核巨噬细胞浸润。栓塞后24h肺组织病理，模型组有轻度中性粒细胞以及单核巨噬细胞浸润，而CUR治疗组病变较模型组减轻。

3.2各组大鼠肺组织NF-κB阳性细胞数 免疫组化染色结果显示，肺组织中NF-κB阳性细胞表达呈棕褐色的颗粒，在肺泡细胞、支气管上皮细胞、支气管平滑肌以及巨噬细胞周围均有不同程度的表达。栓塞后6、24h，模型组NF-κB阳性细胞数显著高于正常对照组（P＜0.01），CUR治疗组显著低于模型组（P＜0.01），见表1。

表1 各组大鼠肺组织NF-κB阳性细胞数比较（） 个

表1 各组大鼠肺组织NF-κB阳性细胞数比较（） 个

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01

3.3各组大鼠肺组织NF-κB表达水平 Western blot结果显示，栓塞后6、24h，模型组NF-κB蛋白表达水平显著高于正常对照组（P＜0.01），CUR治疗组显著低于模型组（P＜0.01），见表2。

表2 各组大鼠肺组织NF-κB表达水平比较（）

表2 各组大鼠肺组织NF-κB表达水平比较（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01

组别正常对照组假手术组APE模型组CUR治疗组n/只6666 6h 2.25±0.93 3.11±0.75 8.52±0.05* 2.38±0.42△24h 0.52±0.02 0.54±0.02 0.70±0.04* 0.65±0.03△

4 讨论

肺栓塞属中医“胸痹”、“喘证”、“血证”、“痰饮”等范畴。其主要病因病机是气虚、血瘀、痰浊，治疗原则是补气、祛瘀、化痰。姜黄是CUR的母体，是中医临床常用药，具破血行气、祛瘀止痛功效，可治疗气滞血瘀型肺栓塞。我们前期研究中采用相同的大鼠APE模型，并使用不同剂量的CUR进行治疗，结果显示CUR 100mg/kg的剂量能较好地改善APE大鼠的肺损伤[7]，故本实验中姜黄素浓度配制为100mg/ kg。

研究表明[10]，APE存在肺动脉以及其分支的阻塞，可引起一系列炎症反应。NF-κB可使炎症过程放大和持续。目前已发现多种NF-κB的抑制剂，然而它们副反应较多，故未能在临床上得以普及[11]。有研究表明[12]，小青龙汤、六君子汤、麻杏石甘汤等以补气、化痰为主的中药方剂可抑制NF-κB的活性。而现代研究也发现CUR有抑制炎症反应之作用，能抑制多种细胞因子的表达。由此我们推想，CUR是否可通过抑制NF-κB的活性从而发挥抑制炎症反应的作用？本实验中肺组织病理检查提示典型的APE血栓及肺泡坏死出血等病理表现，表明该动物模型制备成功。经CUR治疗的肺组织病变减轻、炎性细胞浸润减少，提示CUR能够改善APE大鼠肺的病理损伤，能有效治疗APE大鼠。栓塞后肺组织NF-κB蛋白表达水平定性、定量检测结果显示，栓塞后6h及24h CUR治疗组NF-κB的阳性细胞计数明显低于模型组，接近正常对照组和假手术组。栓塞后6h和24h时，Western blot结果也支持这一点。上述结果表明，肺栓塞后NF-κB起一定的介导作用，参与APE后细胞因子的表达调控，而CUR通过抑制NF-κB转录因子的表达而起治疗作用。我们既往研究发现，APE大鼠存在多种炎症因子，CUR能够抑制APE大鼠IL- 1β、IL-8及TNF-α等的表达水平[7,13]。故我们推测，APE后栓子进入肺动脉，继而引起血管壁内皮细胞的机械损伤、缺血缺氧，促使NF-κB活化，继发炎症反应，促进局部产生炎症因子如IL-1β、IL-8、 TNF-α等，而加重肺损伤[14-16]。而CUR通过抑制NF-κB转录因子，从而抑制IL-1β、IL-8、TNF-α等炎症介质的表达，破坏炎症的级联反应，改善APE的肺部损害。

CUR可通过抑制APE大鼠肺组织中NF-κB转录因子的表达水平，破坏其炎症的级联反应，进而改善APE大鼠肺组织损伤，这可能是其干预APE的机制之一。

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Effects of Curcumine on NF-κB in Acute pulmonary Embolism Rats

ZHANG Wei,WANG Lingcong.The First Affiliated Clinical Medical College,Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou(310006),China

Objective To study the effects of curcumine（cur）on NF-κB in lung tissues of rats with acute pulmonary embolism（APE）.Methods Forty-eight SD healthy rats were randomly divided into 4 groups:control group, sham group,APE model,and curcumine group,with 12 rats in each group.APE model was made by autologous blood clot.At 6 h and 24 h after embolism,6 rats from each group were sacrificed to recover lung tissues for pathological examination and immunohistochemical staining of NF-κB positive cells and western blot of NF-κB expression.Results Typical thrombus and alveolar hemorrhage necrosis were seen in the pathological examination of APE rats,and curcumine reduced the damage.Immunohistochemical results showed that different levels of NF-κB were expressed in macrophages,bronchial epithelial cells,bronchial smooth muscle,and alveolar cells.At 6 h and 24 h after embolism,the count of NF-κB positive cells was obviously fewer in curcumine group than that in model group（P＜0.001）,and was not significantly different between curcumine group and control and sham groups.The level of NF-κB protein in the lung tissue was lower in curcumine group than that in model group（P＜0.01),but did not differ between curcumine group and control and sham groups.Conclusion Curcumine can lessen the damage to the lung in APE rats by inhibiting the expressions of NF-κB.

rats;pulmonary embolism;curcumine;NF-κB

2013-09-30

浙江省自然科学基金资助（No.LY12H29005）

通迅作者：王灵聪，E-mail:wlc501@139.com