马克斯克鲁维酵母制备生物质乙醇研究进展*

陈小燕，许敬亮，袁振宏，梁翠谊，张 宇

（中国科学院广州能源研究所，中国科学院可再生能源重点实验室，广州 510640）

马克斯克鲁维酵母制备生物质乙醇研究进展*

陈小燕，许敬亮，袁振宏†，梁翠谊，张 宇

（中国科学院广州能源研究所，中国科学院可再生能源重点实验室，广州 510640）

利用高温酵母进行高温乙醇发酵，因其能量损耗低、发酵速度快、染菌机率低等优点，成为生物质乙醇发酵生产的新方向。相比传统酵母，马克斯克鲁维高温酵母具有良好的耐温适应能力、更宽泛的底物利用能力、良好的发酵性能、超强的分泌能力、适于分子生物学操作等优势，在生物质乙醇发酵方面显示巨大潜力。本文从底物利用能力、基因重组方法、发酵方法等方面总结了马克斯克鲁维酵母在生物质乙醇发酵方面的发展概况。

马克斯克鲁维酵母；生物质乙醇；菌株改造

0 引 言

相比传统酵母发酵生产乙醇，高温酵母乙醇发酵更适于工业化生产。首先，高温发酵过程减少了高温预处理或酶解冷却至低温发酵所需的能量损耗。其次，高温酵母繁殖速度快，容易形成生长优势，能显著抑制其它微生物的生长，降低常温微生物污染的风险。同时，高温下可以得到更高的糖化与发酵效率，并且有利于产物的抽提与浓缩。因此，开发利用性能优良的高温酵母成为乙醇发酵研究的热点。马克斯克鲁维酵母（Kluyveromycesmarxianus）由于能在 40℃以上生长并进行乙醇发酵而备受关注。马克斯克鲁维酵母在分类学上与酿酒酵母具有一定的亲缘性，并与乳酸克鲁维酵母一样获得美国食品添加剂的安全性指标（Generally Regarded as Safe, GRAS）认证和欧洲“安全资格认定”（Qualified Presumption of Safety, QPS）认证[1]。与前两者相比，马克斯克鲁维酵母因其可利用底物广泛、生长速率快、耐热、蛋白分泌能力强以及更适合于生物工程改造与应用而备受工业生产的青睐。本文就马克斯克鲁维酵母菌利用生物质乙醇发酵的研究进展进行简要的概括和总结。

1 马克斯克鲁维酵母的分类

马克斯克鲁维酵母最早被命名为Saccharomyces marxianus[2]，后来由于其子囊形态、发酵能力、菌株间杂交能力与Saccharomyces（简写为S.）存在较大区别，于1956年更名Kluyveromyces（简写为K.）[3]。随着基因测序的快速发展，最初基于生理生化形态等特征的分类方法被弱化，根据不同菌株核糖体大亚基的26S rDNA的D1/D2区域序列差异性的菌种分类方法更科学、合理[4]。基于此方法，Kluyveromyces属重新被分为6个分枝，具体的进化树分析见图1。

图1 不同Kluyveromyces种的亲缘关系[4]Fig. 1 The relationship betweenKluyveromycesspecies[4]

2 生物质原料底物利用能力

马克斯克鲁维酵母能利用多种不同的单糖和多糖复合物进行代谢和生长，其中生物质底物包括：木质纤维素原料、乳清、菊粉等。关于马克斯克鲁维酵母利用生物质原料生产乙醇的报道非常多，本文列举出其中部分比较典型的例子，见表1。

2.1 木质纤维素原料

木质纤维素是世界上广泛存在且最为廉价的糖发酵原料，由于其结构紧凑，不易被直接利用，要水解得到可发酵单糖需要经过特定的预处理和生物酶解过程。纤维素的酶解多数可在40℃～50℃高温条件下进行，而高温酵母的乙醇发酵温度范围为30℃～45℃，高温酵母的利用使得纤维素的酶解和发酵可以在同一温度下进行，有效减少了传统酿酒酵母酶解-发酵降温过程所造成的能源消耗。

表1 马克斯克鲁维酵母菌株利用生物质原料发酵生产乙醇Table 1 Ethanol production byK.marxianususing various biomass materials

基于其高温发酵特性，国内外对马克斯克鲁维酵母利用各种不同的木质纤维素原料成功制备燃料乙醇的研究报道日益增多。这些研究报道结果显示，马克斯克鲁维酵母可以在30℃～45℃温度下利用多种纤维素原料进行乙醇发酵，包括各种农产品副产物与废弃物，如稻杆、麦杆、水果榨汁后的残渣等，以及一些能源草类植物，如柳枝稷、狼尾草等。

Castro等[5]发现五株K. marxianus都能在45℃高温条件下利用酸处理后的稻杆进行发酵产醇，其中发酵性能最佳的是K. marxianusNRRL Y-6860。该菌株在 30℃和 45℃的发酵温度下的发酵能力均优于S.cerevisiae，在45℃时生成乙醇浓度达21.5 g/L，转化率为0.44 g/g葡萄糖，达理论转化率的86%，产醇速率为3.63 g/(L·h)。Tomás-Pejó等[6]以蒸气爆破后的麦麸为底物，分析不同发酵策略对K. marxianusCECT 10875乙醇产率的影响，结果显示经过 12 h的分批补料同步糖化发酵过程，CECT 10875可利用含 10%固形物的麦麸混合液进行发酵生成乙醇最高浓度达36.2 g/L，转化率为0.33 g/g葡萄糖，为理论值的 64.5%。Suryawati等[7]利用K. marxianusIMB4以高温液态水处理后的柳枝稷为原料进行乙醇发酵，同时分析了预处理条件对后续乙醇发酵的影响，结果显示210℃处理15 min后的柳枝稷，经过45℃同步糖化发酵得到乙醇的最高浓度为16.8 g/L，转化率为72%。腰果梨渣含有丰富的纤维素，是巴西果梨汁产业中的副产物，其稀酸水解液中约含有29 g/L葡萄糖、25 g/L木糖，Rocha等[8]以腰果梨渣为原料发酵生产乙醇，经过K. marxianusCE025发酵48 h后达到最高乙醇浓度为12.36 g/L，乙醇得率为0.417 g/g葡萄糖，转化率为81.6%。由于纤维素原料需要经过一定的预处理过程才能将其紧致结构破坏，不同的预处理方式对后续的酶解发酵有较大影响，导致马克斯克鲁维酵母对各种纤维素底物的转化能力也有一定的差别。但是已知的这些数据表明，马克斯克鲁维酵母的乙醇转化能力基本可达65%以上，最高可达86%。

通过改善预处理工序以及优化发酵工艺，马克斯克鲁维酵母对纤维素底物的乙醇发酵能力会得到进一步提高。研究发现在发酵过程中，添加一定量的纤维素酶与半纤维素酶也有利于高温酵母纤维素乙醇发酵效率的提高。García-Aparicio等[9]发现在乙醇发酵过程中添加一定量的内切木聚糖酶有利于葡聚糖的转化，得到更高的乙醇得率，尤其是在酶解早期效果更加显著。经过木聚糖酶的处理后，K. marxianusCECT 10875对含10%不可溶固体的大麦桔杆底物的乙醇转化率提高了10%。漆酶能有效地去除发酵原料中木质素酚类物质对高温酵母的毒性抑制作用。K. marxianusCECT 10875不能在蒸气爆破的小麦桔杆原浆中生长，更不能进行发酵，Moreno等[10]用漆酶对底物进行处理后，K. marxianusCECT 10875的生长能力和乙醇发酵能力得到完全改善，最终获得的乙醇得率为0.36 g/g葡萄糖，为理论值的70%。同步糖化发酵过程中，通过添加纤维素酶的作用不仅可以使发酵菌株直接利用纤维素底物发酵生产乙醇，同时，菌株的发酵温度以及发酵性能也会得到很大的提高。Pessani等[11]在同步糖化发酵过程中添加了一定量纤维素酶后，K. marxianusIMB3对高温液态水预处理柳枝稷的发酵能力有大幅度提高，发酵最佳温度达45℃，最高乙醇浓度达22.5 g/L，得率达到理论值的86%。Yanase等[12]通过表面展示技术将葡萄糖苷酶和葡聚糖酶固定在K. marxianusNBRC1777细胞表面，产生的重组菌株K1在 48℃的发酵能力最佳，比原菌株的最佳发酵温度提高了8℃，同时乙醇发酵能力提高了1.7倍，乙醇转化率为0.47 g/g葡萄糖，达到理论值的92%，分析其原因，可能是由于纤维素酶分解生成的葡萄糖产物高浓度地富集在发酵菌株细胞表面，非常有利于葡萄糖被及时有效地转运至细胞内进行下一步的乙醇发酵。纤维素酶、半纤维素酶在高温乙醇发酵过程中不仅仅发挥酶解的作用，同时也起到脱毒的效果。因此，合理有效地利用纤维素酶、半纤维素酶，对马克斯克鲁维酵母发挥高温发酵优势有极大促进作用，进而有效提高乙醇转化效率。

2.2 乳清

乳清是乳制品行业的主要副产物，乳清中的主要成分包括乳糖、蛋白质、矿物质和脂类物质，其中乳糖含量达4%～6%。虽然有多种方式可以对乳清进行再利用，但是每年全世界的乳清产量可达108t[13]，仍会带来严重的环境污染问题和资源浪费。

分子生物学研究结果显示K. marxianus具有乳糖转化所需的的β-半乳糖苷酶基因 LAC4和乳糖通透酶基因LAC12，二者在K. marxianus基因组位置毗邻，且由同一个双向的启动子控制表达[14]。马克斯克鲁维酵母利用乳糖的能力被应用于乳清的再利用，通过将乳清中的乳糖转化成乙醇，避免了乳酪生产的资源浪费和环境污染问题，同时增加了清洁能源——生物质乙醇的生产原料来源。目前，已有许多乳制品大国都在致力于开发研究性能优良的克鲁维酵母用于乳清的再利用，并对酵母的乳糖发酵工艺进行优化，许多研究均已取得不错的进展。

巴西某奶制品厂[14]发现1株名为UFV-3的马克斯克鲁维酵母菌株具有很高的 β-半乳糖苷酶活性，通过发酵优化，K. marxianusUFV-3能有效地将乳清转化成乙醇，乙醇浓度最高可达80 g/L，得率为0.535 g/g乳糖。Aktas等[15]发现K. marxianusY-8281具有很高的乳清利用效率，经18 h发酵过程后，95%的乳糖被转化再利用。Salman等[16]也尝试利用K. marxianusMTCC 1288直接从粗乳清液进行乙醇发酵，经过22 h的发酵过程，乳糖基本消耗完全。

为了减少乳清中其他微生物（主要是乳酸菌）的污染，往往在乳清进入下一步的发酵之前进行一定的处理，主要的处理方式有三种：（1）喷雾制成干粉，此方法成本比较高，但是后期可以对乳糖含量进行调控，获得最优的乳糖发酵浓度；（2）灭菌法，运行成本也比较高，但是处理后的乳清能在较长时间内保持无菌状态；（3）冷冻法，将乳清存储于2℃～5℃的空间内，此方法运行成本相对低廉，但如需长时间的转运将会增加存储成本。目前也有报道[17]显示不灭菌或不冷冻的乳清中乳糖的含量会有所降低，但是不会影响K. marxianus对乳糖利用，即使开始时有部分乳糖被乳酸菌转化成乳酸，但是K. marxianus仍能将剩余的乳糖有效地发酵成乙醇，阻止乳酸的继续生成。Christensen[17]等发现灭菌或冷冻处理后的的乳清能保证几乎所有的乳糖被转化生成乙醇，且冷冻与灭菌处理的效果没有明显区别，在相同的发酵条件下，乙醇转化率相近，为（0.44～0.48）g/g乳糖。因此，各个单位对乳清的前期保存方法可以因地制宜，选择更适合自身的处理方式。

K. marxianus利用乳清发酵产乙醇过程中的各个条件也被考察。通过对耗氧量和乳糖浓度的摸索，Silveira等[14]发现在乳糖浓度为50～170 g/L、温度为 30℃、氧含量相当低的条件下，K. marxianusUFV-3的乳糖–乙醇转化率接近理论值，乳糖浓度为130 g/L时生成乙醇的浓度最高。K. marxianusY-8281[15]的乳清-乙醇发酵分析表明，最优的发酵条件为发酵温度31℃、pH值6.0、乳糖浓度45 g/L。Zoppellari等[13]考察了不同的发酵条件，包括批料、温度、耗氧量、半连续发酵等因素对K. marxianus var. marxianusCBS712发酵乳酪废料的影响。实验结果表明，在温度为28℃、厌氧、半连续发酵条件下得到的乙醇浓度最高为19.32 g/L，废料中的乳糖在发酵结束时基本消耗完全。Diniz等[18]开展了 29个发酵实验，并利用响应面法分析不同因素对K. marxianusUFV-3乳清乙醇发酵的影响，结果显示温度是最重要的影响因素，其次为pH、菌体浓度和乳糖含量。在温度为33.3℃～38.5℃、pH值为4.7～5.7、菌体浓度OD6002.4～3.3、乳糖浓度为50～108 g/L发酵条件下，乙醇转化率可达 90%以上。研究进展显示，虽然不同K. marxianus菌株的最佳发酵工艺条件各不相同，但仍然保持在一定的范围之内：温度为30℃～40℃、pH值为弱酸性（4.5～6）或自然pH值、厌氧或低氧浓度环境，K. marxianus的发酵性能最优。

由上可见，马克斯克鲁维酵母生产乳清乙醇在乳制品行业尤其是乳制品大国起着相当重要的作用，也为清洁能源的生产拓宽新的发展道路。

2.3 菊粉

菊粉（inulin）是由果糖分子经β-2,1糖苷键脱水形成的线型分子，是菊芋块茎中糖的主要存在形式，其含量可达菊芋干重的70%。菊芋，又称洋姜，在我国大部分地区均有种植，其生命力极强，能耐受零下40℃甚至更低的温度。在我国荒漠地区可大面积种植，起到治沙、固沙、保水的作用。1939年，马克斯克鲁维酵母（当时称为Saccharomyces marxianus）的菊粉发酵能力就已经被发现，该菌株能产生将菊粉水解成寡糖的菊粉酶（inulinase）。基于这一特性，研究人员逐渐开展马克斯克鲁维酵母高效生产菊粉酶的研究[19,20]。由于菊芋粉能够被马克斯克鲁维酵母直接酶解，菊芋块茎的处理过程也相对简单、容易，主要包括去皮、切片、干燥及磨粉等过程。目前，马克斯克鲁维酵母利用菊芋的发酵条件研究也有一定的进展，对于同一菌株，不同的发酵温度、pH值对发酵效率影响不大，乙醇转化率多数可达80%～90%。

大连理工大学的袁文杰[21]驯化了一株马克斯克鲁维酵母K.marxianusYX01用于乙醇的发酵生产。通过对该菌株的产菊粉酶培养条件的研究，在最佳产酶条件下，即菊粉浓度为235 g/L时，乙醇最终浓度达到92.2 g/L，转化率为理论值的85.5%。Hu等[22]发现K.marxianusPT-1在35℃和40℃条件下的菊芋粉发酵效率相近，经过48 h的批式发酵，乙醇最高浓度达到74.4 g/L，乙醇得率为理论值的90.0%。Kim等[23]将整个菊芋作为生物质乙醇生产原料，包括茎杆处理得到的葡聚糖以及块茎中的菊粉分别用K. marxianusCBS1555进行乙醇发酵，批式补料发酵工艺后产出的乙醇浓度为 70.2 g/L，最高乙醇得率为0.265 g/g总菊芋生物质，转化率为理论值的83.6%。Bajpai等[24]发现固定化的马克斯克鲁维酵母对乙醇发酵性能高于游离细胞。酵母细胞未固定时，在25℃～35℃温度条件下乙醇得率较为稳定，温度超过35℃后，发酵能力迅速下降。酵母细胞固定后，在25℃～45℃温度下乙醇得率都很稳定，在40℃时达到峰值。

菊芋具有耐旱、耐盐的特点，可以不占用耕地，还可以促进我们荒漠地带和滩涂地的开发，有利于减少水土流失 ，促进农业经济的可持续发展。与淀粉质原料相比，菊芋是燃料乙醇产业规模化发展的理想原料之一。利用克鲁维酵母直接发酵菊粉生产乙醇的一步法工艺，省去了菊粉的酸解或酶解过程，降低过程成本；同时，一步法工艺可以防止菊粉酶解产物的抑制现象，具有良好的工业发展前景。

3 高效乙醇发酵马克斯克鲁维酵母菌株的选育与改良

3.1 高效乙醇发酵马克斯克鲁维酵母菌株的选育

长期以来，高效的乙醇发酵高温酵母的选育主要来自于自然界筛选结合高温驯化，目前已从各种酒精发酵产物、奶制品或乳酸发酵液中筛选得到数量可观的马克斯克鲁维酵母菌株。王远微等[25]从川西北部分牧区的 10份传统发酵牦牛酸奶样品分离得到16株马克斯克鲁维酵母。李新玲等[26]从新疆天润公司西山奶牛场原料乳中分离、纯化得到一株K. marxianus var. marxianusA3，该菌株生长速度快，8 h后即达到对数生长期。从酒精饮料中分离得到的马克斯克鲁维酵母也有不少，如分离自香蕉酒精饮料的K. marxianusNRRL Y-6860[5]，分离自柑橘皮压榨汁的K. marxianusNRRL Y-6373[5]。

高温筛选是得到性能优良马克斯克鲁维酵母的有效途径，多数的克鲁维酵母菌株都可在大于30℃，如37℃、42℃、45℃、50℃和52℃等高温条件下，通过底物筛选或富集培养的方法筛选得到。Margaritis等[27]对8株K. marxianus的木糖发酵乙醇能力进行了分析，其中1株K. marxianusSUB-80-S菌株表现最为突出，能在48 h内将20%木糖全部消耗，乙醇转化率为0.28 g/g木糖，是理论值的55%。Banat等[28]通过富集培养方法成功地分离得到几株高温酵母：K. marxianusIMB1，IMB2，IMB3，IMB4，IMB5，这些菌株均能在高达52℃高温条件下生长，并能在45℃和50℃高温下进行乙醇发酵。从甘蔗汁的乙醇发酵液中分离到的K. marxianusDMKU 3-1042能够在 40℃和 45℃利用苷蔗汁发酵产出高浓度的乙醇[29]。Grba等[30]对5株K. marxianus菌株利用脱蛋白乳清生产乙醇的能力进行了分析，从中筛选到两株优秀菌株K. marxianusVST 44和ZIM 75。Hu[22]等以洋姜茎杆和块茎以及水果为原料，在40℃高温孵育 5 d后，筛选得到发酵性能优于S. cerevisiaeJZ1C的K. marxianusPT-1。从甘蔗渣水解液中分离得到的K. marxianusDMB1能在48℃高温下生长并发酵生产乙醇，且48℃条件下乙醇得率（0.467 g/g总糖）高于30℃（0.415 g/g总糖）[31]。

3.2 马克斯克鲁维酵母菌株的改良

虽然部分自然筛选得到的马克斯克鲁维酵母菌株能在高温条件下进行乙醇的发酵，但多数菌株在某些方面却表现出一定的不足，如耐醇能力较低，不能进行高浓度乙醇的生产；部分菌株虽能在高温条件下生长，但其发酵效率远远低于酿酒酵母；不能直接利用木糖、长链葡萄糖寡糖等底物；底物反馈抑制等因素降低乙醇发酵效率。为了获得能应用于大规模生产的性能优良的发酵菌株，研究人员广泛地采取分子生物学手段提高马克斯克鲁维酵母的乙醇发酵能力。

3.2.1 基因重组技术用于马克斯克鲁维酵母菌株的改良

基因重组技术是分子生物学的基本手段，研究人员可借其深入了解马克斯克鲁维酵母菌株的生理生化性能，同时为工业菌株的改良向可控方向发展提供了良好的技术保障。马克斯克鲁维酵母与酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母具有很近的亲缘关系，最初对马克斯克鲁维酵母的基因重组操作多数是参照后二者的成功经验。目前，应用于马克斯克鲁维酵母菌株的转化方法主要为酿酒酵母改良电转化法和醋酸锂方法。1984年，研究人员对克鲁维酵母外源基因导入方法进行了初步尝试[32]。随后，研究人员发现来源于K. drosophilarum的质粒pKD1的基因组成与酿酒酵母的2μ质粒很相似，含有3个开放阅读框、一对反向重复序列（IR序列）、自主复制序列（Autonomously replicating sequence, ARS）和一个顺式作用元件。不同的是，pKD1不能在酿酒酵母中自主复制，而能够在K. lactis中自主复制，并且在宿主菌中极其稳定。经过特定的改造，包括引入抗性基因和筛选基因等操作，pKD1被成功转化至马克斯克鲁维酵母K. marxianusCBS 6556和CBS 712菌株中并保持遗传稳定性。虽然pKD1质粒的转化效率仍然相当低，但是以该质粒为基础的改良载体成为之后马克斯克鲁维酵母菌株表达质粒的首选。基于pKD1改良的穿梭载体pKDU7能在多个Kluyveromyces和Saccharomyces菌株中表达外源基因，通过对质粒中各个元件的分析，发现pKD1任何一个功能元件被打断后形成的质粒都极不稳定，pKD1所有重要功能元件的完整性对于pKDU7的稳定性与转化效率起到关键作用。

除了通过利用质粒的转化方法外，线性PCR片段也被成功转化至马克斯克鲁维酵母菌株中。在转化过程中添加DNA转运载体，Nonklang等[33]将含有S.cerevisiae的ScURA3线性DNA片段成功重组至URA3缺陷型菌株K. marxianus的基因组上，转化效率可达4.2 × 103个菌落/μg DNA。同时，在S. cerevisiae和K. lactis菌株中成熟运用的Cre-loxP重组交换系统也被用于K. marxianusCBS 6556的基因交换[34]，基因组上LAC4基因序列被成功敲除。

除优良的基础表达元件-自主复制序列（ARS）外，外源基因的表达强度还依赖于启动子的强度以及信号肽能否及时有效地将外源蛋白分泌至培养基中。外源蛋白分泌到细胞外，不仅能有效减少冗余蛋白对宿主细胞的毒害性，同时也可以加强目的蛋白的有效富集，便于酶蛋白的下游收集与纯化工作。到目前为止，已开展了大量的工作用于寻找马克斯克鲁维酵母表达外源蛋白的理想启动子和信号肽序列。Bergkamp等[35]基于马克斯克鲁维酵母良好的菊粉酶生产分泌能力，将菊粉酶的启动子（INU）和信号肽序列用于外源α-半乳糖苷酶基因的高效表达。相比酿酒酵母PGK和GAL7启动子，在INU调控下蛋白生产量可达153 mg/L，且99%的目的蛋白都分泌到培养基中。该启动子的另一优势还在于通过改变碳源的添加时间可以控制外源蛋白的表达时间。Pecota等[36]也尝试用四环素可抑制启动子系统来调控外源蛋白的表达。这一系统不需要特定的诱导物，外源蛋白在细胞对数生长期基本不表达，在生长期后期外源蛋白浓度迅速增加，外源蛋白的表达不会抑制宿主的繁殖。除了诱导型启动子外，研究人员也分析了组成型启动子在马克斯克鲁维酵母蛋白表达效率，如嘌呤-嘧啶通透酶基因的启动子[37]，来源于酿酒酵母的组成型启动子 PCYC、PTEF、PGPD和PADH等[38]。

目前，已有大量关于通过基因重组方法来提高和改善马克斯克鲁维酵母乙醇发酵能力的报道，并取得一定的效果。Hong等[39]将耐热的葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡萄糖苷酶引入K. marxianusNBRC1777，3个酶在宿主菌株中获得成功表达，并以纤维二糖和羧甲基纤维素为底物产生乙醇量达43.4 g/L。Yanase等[12]将Trichoderma reesei的内切葡聚糖酶和Aspergillus aculeatusβ-葡萄糖苷酶在K. marxianus表面展示表达，重组菌株在24 h内将纤维素葡聚糖转化成乙醇，转化率高达92.2%。

3.2.2 原生质体融合技术用于马克斯克鲁维酵母菌株的改良

原生质体融合技术因其杂交效率高、遗传信息传递量大等优点而广泛应用于微生物菌种的改良，这一技术也被用于马克斯克鲁维酵母菌株的改良。Sakanaka等[40]分离到一株耐热K. marxianusTS87菌株，将其与酿酒酵母S. cerevisiaeTS8进行融合，但是产生的融合子发酵能力严重下降，且耐热性也不及亲本菌株。针对酵母菌株原生质体制备困难的问题，李英军[41]、包伟霞[42]等分别研究了亲本菌株的菌龄、酶解温度、酶解时间、酶浓度对原生质体制备与再生的影响。亲本菌株的菌龄以对数生长期早期至中期（8～12 h）较佳，太早会降低再生率，但一旦进入稳定期后，细胞老化，不易破壁。酶的浓度以1%～1.5%为宜，原生质的生成率随酶浓度升高而提高，但再生率则相反。常用的渗透压稳定剂有KCl、NaCl等无机盐和蔗糖、甘露醇、山梨醇等，不同的稳渗剂对原生质体的制备影响不大，但对再生率有一定的影响，可根据不同的菌株进行选择。

4 马克斯克鲁维酵母的乙醇发酵工艺

目前乙醇发酵工艺已经相当成熟，K. marxianus生产乙醇的发酵培养方式也有不少：不同底物浓度下的批式发酵（Batch fermentation）、补料批式发酵（Fed-batch）、连续式发酵（Continuous system）、分步发酵（Separate hydrolysis and fermentation）、同步糖化发酵（Simultaneous saccharification and fermentation, SSF）等。目前，实验室多数采用批式发酵和同步糖化发酵方法来研究K. marxianus的乙醇发酵能力[5-7,10-14,16]。

4.1 批式发酵和补料批式发酵

批式发酵，是指每一次发酵通过一个批次完成。基本流程如下：将所有的培养基一次性加入发酵罐中，灭菌、接种后进行发酵。由于其操作简单，批式发酵多数在实验室阶段尤其是小量试验中用于研究温度、pH、需氧量、接种量等对乙醇产率的影响。

补料批式发酵，又称为半连续发酵或流加发酵，在发酵早期先加入部分体积的发酵培养基与发酵菌株，发酵期间连续或间歇性地补加新鲜的培养基。补料批式发酵的优势在于可以降低高深度底物的抑制、减缓中间产物累积产生的反馈抑制等对发酵过程的不良影响。Hadiyanto等[43]分析比较了批式发酵与补料批式发酵在K. marxianus乳清发酵乙醇的不同效率，结果显示无论是菌株生物质生长速率还是乙醇生成量、乙醇生成速率，补料批式发酵都优于前者。补料批式发酵后的乙醇浓度为7.9626 g/L，是批式发酵（4.6362 g/L）的1.7倍。

4.2 同步糖化发酵

批式发酵中的原料多为可以直接被酵母利用的单糖或多糖，由于马克斯克鲁维酵母不含有将木质纤维素降解成单糖的纤维素酶，它不能直接利用木质纤维素。同步糖化发酵即在发酵过程中添加一定量的纤维素酶，使得酶解与发酵过程同时进行。

目前，K. marxianus通过同步糖化发酵方法生产乙醇的报道为数很多，利用多种不同的天然底物，如柳枝稷、大麦桔杆、麦麸、甘蔗渣等。然而，同步糖化发酵工艺中糖化温度与发酵温度的不一致仍是其重大缺陷，还需要大量的工作来解决这一问题以达到更优的乙醇发酵效率。

4.3 发酵方法的优化改良

针对目前各种不同发酵工艺存在的不足之处，对发酵工艺的改良优化工作正在不断开展。Tomáspejó等[6]采用的分批补料同步糖化方法（batch-SSF）可以直接利用含固体悬浆进行发酵，比常规的 SSF发酵方法产出的乙醇多20%。Suryawati等[7]尝试将酵母细胞固定在不同的介质表面，如钙凝微球、磁珠、矿物质微珠等，可以将乙醇发酵的最佳温度提高10℃，同时大大缩短发酵时间，提高乙醇产率。在同步糖化发酵工艺中添加一定量的木聚糖酶可促进早期的酶水解过程，提高高温酵母利用含固体悬浆液的发酵能力，乙醇得率最高达到70%。添加葡萄糖苷酶能有效地消除纤维二糖对纤维素水解酶的抑制作用，提高同步糖化发酵的乙醇浓度和产率[44]。改变溶氧量对马克斯克鲁维酵母的醇发酵也有一定影响，K. marxianusYX01在通气量为50 mL/min和100 mL/min时菌体生长速度快、发酵时间缩短，然而在不通气条件下醇转化率则更高[21]。与好氧环境相比较，K. marxianusUFV-3在低氧和缺氧条件下乙醇得率与底物转化效率更高[14]。

5 展 望

马克斯克鲁维酵母表现出的耐高温、快速的生长速率、可利用多种生物质底物、适于高温发酵等特性，为生物质乙醇发酵开拓了新的发展思路。然而，目前对克鲁维酵母的研究仍处于初级阶段，关于该菌株的报道仍然相对较少，对高温酵母的基础代谢、生理生化特性仍有待进一步了解与深入。要更好利用马克斯克鲁维酵母进行高温乙醇发酵，还需要持续不断的研究与创新。针对目前存在的一些问题，对今后的研究提出几点建议：

（1）在原料方面，继续拓展可利用原料，寻找类似菊芋易水解、易繁殖，不与人畜竞争的原料；进一步分析和完善各种原料的物料特征和发酵效率，形成不同类型原料有不同的利用模式，保证各种原料的利用效率。

（2）菌株方面，积极发掘性能优良的发酵菌株。利用分子生物学技术，逐步深入对马克斯克鲁维酵母的基因组学、转录组学、代谢组学的研究，通过对优良菌株的适当改造，进一步优化高温酵母的发酵特性，加强菌株的高温发酵优势，缩小酶解和发酵之间的温度变化。逐步解决发酵过程存在的毒性影响与抑制作用，例如利用外部介质优化菌株的发酵性能，保证发酵菌株的发酵寿命和再生能力。

（3）发酵工艺方面，优化和完善现有发酵工艺。综合几种发酵工艺的优点，例如可将间歇式发酵与同步糖化发酵结合，减缓产物抑制，提高原料利用率。引入高效的产物收集分离装置，减缓乙醇高浓度累积产生的有机溶剂毒性。另一方面，将高浓度乙醇发酵应用于高温发酵，开发相应的发酵工艺。

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Studies in Biomass Ethanol Production by Kluyveromyces marxianus

CHEN Xiao-yan, XU Jing-liang, YUAN Zhen-hong, LIANG Cui-yi, ZHANG Yu
(CAS Key Laboratory of Renewable Energy, Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China)

With the advantages of low energy-cost, rapid fermentative rate, and less contaminant probabilities, ethanol fermentation at high-temperature has becomes the emerging preference for biofuel production. Compared to conventional yeast,Kluyveromyces marxianusshows the abilities of wider substrate utilization, favorable fermentative performance, powerful capability of protein secretion, suitable for molecular manipulation, which is potential for bio-ethanol production. This paper reviewed the advances ofKluyveromyces marxianusin the field of biomass ethanol production.

Kluyveromyces marxianus; biomass ethanol; DNA recombinant technology

TK6

A

10.3969/j.issn.2095-560X.2014.05.007

2095-560X（2014）05-0364-09

陈小燕（1981-），女，硕士，助理研究员，主要从事生物质醇工程菌株构建研究。

许敬亮（1977-），男，博士，研究员，硕士生导师，主要从事纤维素生物醇和酶工程研究。

袁振宏（1953-），男，博士，研究员，博士生导师，长期从事生物质能技术的研究、开发与管理。

梁翠谊（1986-），女，学士，助理研究员，主要从事纤维素酶菌株筛选及酶性质研究。

张 宇（1982-），男，博士，副研究员，硕士生导师，主要从事燃料乙醇等木质纤维素资源化研究。

2014-08-01

2014-08-19

国家自然科学基金（2117623，21211140237）；国家 863计划（2013AA065803）；中科院院地合作项目和广州市科技攻关项目（2013J4300026）

† 通信作者：袁振宏，E-mail：yuanzh@ms.giec.ac.cn