亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与肺腺癌化疗疗效的关系

董翠梅 康马飞 赵燕仪 林 静 陶利英

作者单位：541001 桂林 桂林医学院附属医院肿瘤内科

临床研究

亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与肺腺癌化疗疗效的关系

董翠梅 康马飞 赵燕仪 林 静 陶利英

作者单位：541001 桂林 桂林医学院附属医院肿瘤内科

目的 观察肺腺癌患者亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T多态性与化疗疗效的关系。方法 化疗前抽取92例肺腺癌患者外周血液，用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）方法检测MTHFR基因C677T多态性，并分析其与化疗的疗效关系。结果 92例肺腺癌患者中，MTHFR基因C677T野生型（CC）的分布为60.9%（56/92），纯合突变型（TT）为14.1%（13/92），杂合突变型（CT）为25.0%（23/92）。一线化疗方案使用培美曲塞/卡铂的疗效：野生型（CC）PR 20例，SD 19例，PD 17例，总有效率（ORR）为35.7%；纯合突变型（TT）PR 2例，SD 7例，PD 4例，ORR为15.4%；杂合突变型（CT）SD 13例，PD 10例，ORR为0。CC型患者化疗ORR显著高于TT型和CT型者（P=0.001）。CC型与TT型/CT型患者的肿瘤进展时间（TTP）分别为6.2个月和4.7个月，差异有统计学意义（P=0.023）。二线化疗方案使用吉西他滨/奈达铂或多西紫杉醇/奈达铂的疗效：CC型PR 2例，SD 5例，PD 10例；TT型SD 3例；CT型PR 1例，SD 2例，PD 7例，CC型与TT型/CT型患者的ORR比较，差异无统计学意义（P=1.000）。结论 MTHFR基因C677T野生型（CC）肺腺癌患者可能是使用培美曲塞联合卡铂化疗有效的人群。MTHFR基因C677T CC型患者的TTP显著长于TT型患者和CT型患者。MTHFR基因C677T多态性与吉西他滨/奈达铂或多西紫杉醇/奈达铂化疗疗效无关。

肺肿瘤；非小细胞肺癌；亚甲基四氢叶酸还原酶；基因多态性；化疗疗效

亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是叶酸代谢过程的关键酶，参与嘌呤和嘧啶的合成及DNA修复。培美曲塞联合铂类是治疗肺腺癌的一线选择，其他含铂双药联合方案也可在治疗肺腺癌中使用，但其化疗疗效是否与MTHFR基因多态性有关尚不清楚。本研究观察肺腺癌患者MTHFR基因C677T多态性与培美曲塞联合卡铂一线化疗方案及吉西他滨联合奈达铂或多西紫杉醇联合奈达铂二线化疗方案的有效率（RR）和肿瘤进展时间（TTP）的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

2011年9月至2013年2月经病理确诊的Ⅲb/Ⅳ期肺腺癌患者92例，男性38例，女性54例，年龄为40～76岁，中位年龄57岁。化疗前取全血标本提取DNA，使用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）方法检测MTHFR基因C677T多态性，并观察患者化疗的有效率（RR）和肿瘤进展时间（TTP）。一线化疗方案为培美曲塞500 mg/m2，d1；卡铂AUC=5，d1，每21 d为1个周期，每2个周期末予CT扫描检查评价疗效1次。肿瘤进展者改用二线方案化疗，吉西他滨1 000 mg/m2，d1、d8；奈达铂80 mg/m2，d1或多西紫杉醇75 mg/m2，d1；奈达铂80 mg/m2，d1或分子靶向药物治疗，肿瘤缩小或稳定者继续用药，最多用6个周期。无进展者继续用培美曲塞单药维持治疗，直到肿瘤进展为止。所有患者均签署《知情同意书》，所用药物均为同一厂家生产。

1.2 疗效判断标准

按“RECIST 1.1标准”进行疗效评价。分为完全缓解（CR）：所有靶病灶全部消失。部分缓解（PR）：所有靶病灶的长径总和缩小30%或以上。稳定（SD）：肿瘤长径变化介于PR和PD之间。进展（PD）：所有靶病灶的长径总和增加20%以上，或出现新病灶。总有效率（ORR）（%）=CR+PR/（CR+PR+SD+PD）×100%。

1.3 实验方法

1.3.1 标本的采集 化疗前抽取患者静脉血液2 ml于EDTA抗凝管中，用全血DNA提取试剂盒提取基因组DNA，置于-20℃冰箱保存备用。

1.3.2 DNA的提取 ①取200 μl全血放入1.5 ml离心管中，加入20 μg蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，充分混匀，再加入200 μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10 min，冷却后加入100 μl异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀（如样品黏稠不易混匀时可以涡旋振荡15 s混匀）。②将以上混合物（包括可能有的沉淀物）加入一条吸附柱AC中，将吸附柱放入收集管中以13 000 r/min离心30～60 s，弃去废液。③加入500 μl抑制物去除液IR，以12 000 r/min离心30 s，弃去废液。④加入700 μl漂洗液WB，以12 000 r/min离心30 s，弃掉废液。⑤加入500 μl漂洗液WB，以12 000 r/min离心30 s，弃掉废液。⑥将吸附柱AC放回收集管中，以13 000 r/min离心2 min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。⑦取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100 μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65～70℃水浴中预热效果更好），室温放置3～5 min，以12 000 r/min离心1 min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2 min，以12 000 r/min离心1 min。收集DNA溶液，置-20℃冰箱保存。

1.3.3 MTHFR基因C677T多态性的检测 应用Primer Premier 5.0软件设计引物，所有引物由Invitrogen Custom Primers公司合成。MTHFR基因C677T PCR引物序列如下：上游引物为5′-TCA TCC CTA TTG GCA GGT TAC-3′，下游引物为5′-CAG CGA ACT CAG CAC TCC AC-3′。PCR扩增反应体系：模板DNA 3 μl，上、下游引物各 0.5 μl，2×Master Mix12.5 μl，ddH2O补足到25 μl。PCR反应条件为94℃预变性5 min，然后94℃30 s、59℃30 s、72℃45 s，共35个循环，再予72℃延伸7 min。取PCR扩增产物5 μl加入1 μl 10×loading Buffer，混匀后点样在2%的琼脂糖凝胶上。以100 v恒压电泳35 min，在紫外灯下与100 bp DNA Marker对照，如出现有309 bp的目的条带则进行酶切反应。酶切反应体系：去离子水17 μl，PCR产物10 μl，10×Fast Digest Buffer 2 μl，快速酶切酶1 μl，混匀，离心，置于37℃水浴中5 min。取酶切产物5 μl，加入1 μl 6×loading Buffer，混匀后在4%的琼脂糖凝胶上点样。100 v恒压电泳35 min，用溴乙锭染色该酶切片段，然后在4%（p/v）的琼脂糖凝胶电泳显影，可观察到MTHFR C677T 3种类型的条带为CC：309 bp；CT：309 bp，214 bp，95 bp；TT：214 bp，95 bp。

1.4 统计学分析

使用SPSS 19.0软件处理分析数据，计数资料的差别比较用χ2检验或Fisher精确概率法。计量资料的比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTHFR基因C677T多态性分布

MTHFR基因C677T多态性经酶切电泳显示3种条带，其野生型（CC）为309 bp，纯合突变型（TT）为214 bp和95 bp；杂合突变型（CT）为309 bp、214 bp和95 bp。图1。野生型（CC）占60.9%（56/92）；纯合突变型（TT）占14.1%（13/92）；杂合突变型（CT）占25.0%（23/92）。

图1 MTHFR基因C677T多态性的酶切电泳图注：M.Marker；3、4、6.野生型（CC）309 bp条带；1.纯合突变型（TT）214 bp和95 bp条带；2、5.杂合突变型（CT）309 bp、214 bp和95 bp条带。

2.2 MTHFR基因C677T多态性与一线化疗方案化疗后ORR和TTP的关系

化疗后野生型（CC）PR 20例，SD 19例，PD 17例，ORR为35.7%；纯合突变型（TT）PR 2例，SD 7例，PD 4例，ORR为15.4%；杂合突变型（CT）SD 13例，PD 10例，ORR为0。CC型和TT型/CT型患者的ORR比较，差异有统计学意义（χ2=10.954，P=0.001）。CC型和TT型/CT型患者的TTP分别为6.2个月和4.7个月，差异有统计学意义（t=2.312，P=0.023）。

2.3 MTHFR基因C677T多态性与二线化疗方案化疗后ORR和TTP的关系

17例野生型（CC）进展者，二线化疗方案使用吉西他滨（GEM）/奈达铂（NDP）方案化疗10例，结果PR 1例，SD 3例，PD 6例，ORR为10.0%。使用多西紫杉醇（DOC）/NDP方案者7例，结果PR 1例，SD 2例，PD 4例，ORR为14.3%。4例纯合突变型（TT）进展者，除1例改用吉非替尼外，3例用二线方案化疗，使用GEM/NDP方案化疗者2例，结果SD 2例，ORR为0。使用DOC/NDP方案者1例，SD 1例，ORR为0。10例杂合突变型（CT）进展者，二线使用GEM/NDP方案化疗5例，结果PR 1例，SD 1例，PD 3例，ORR为20.0%。使用DOC/NDP方案化疗5例，SD 1例，PD 4例，ORR为0。CC型与TT型/CT型患者的ORR比较，经Fisher精确概率法检验，差异无统计学意义（P=1.000）。CC型和TT型/CT型患者的TTP分别为2.3个月和2.1个月，差异无统计学意义（t=0.588，P=0.568）。

3 讨论

MTHFR基因位于1号染色体短臂上（1p36．3），包括11个外显子和10个内含子，cDNA全长为2.2kb。MTHFR基因是机体一碳基团代谢关键酶，也是甲硫氨酸代谢中的关键酶。目前已发现MTHFR基因有近20个基因突变位点，其中部分多态位点的错义突变是导致酶活性降低、缺失和（或）热稳定性改变的主要机制。目前研究报道较多且与人类疾病关系较大的多态位点是C677T和A1298C。C677C→T是MTHFR最常见的突变，主要引起酶活性下降和热稳定性的改变。由于MTHFR基因的活性降低，抑制了5-甲基四氢叶酸形成的通路，从而增进DNA合成并减少DNA损伤的风险。

在MTHFR基因C677T多态性分布方面，有研究显示，在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）病例中，MTHFR基因C677T C/C型、C/T型和T/T型的频度分别为34.0%、50.5%和15.5%［1］，广东地区汉族NSCLC患者MTHFR基因C677T C/C型、C/T型和T/T型的频度分别为24.0%、52.0%和24.0%［2］。本研究结果显示，在肺腺癌中，MTHFR基因C677T C/C型、C/T型和T/T型的频度分别为60.9%、25.0%和14.1%，与其他研究的基因型分布不一致，分析是否存在不同病理类型之间差异或地区、民族之间的差异，有待进一步研究。

在MTHFR基因C677T多态性与化疗疗效关系方面，有研究观察MTHFR基因C677T多态性与乳腺癌患者化疗敏感性的关系。结果显示，MTHFR基因C677T的T/T型患者的化疗有效率（87.5%）显著高于C/C型患者（52.4%），在CAF方案化疗组患者中，MTHFR基因C677T的T/T型、T/C型患者的化疗有效率（90.0%、68.8%）显著高于C/C型患者（30.8%），认为MTHFR基因C677T多态性对指导乳腺癌个体化治疗具有较高的应用价值［3］。但是，在一项NSCLC研究中，未发现MTHFR基因C677T多态性与NSCLC化疗的疗效有明显关系。而联合分析MTHFR基因C677T多态性A1298C多态基因型与化疗疗效的关系时，发现携带MTHFR基因C677T的T等位基因（C/T型或T/T型）、同时携带A1298C A/A型者的化疗有效率为51.1%，显著高于同时携带C677T的C/T型及A1298C的C等位基因者（12.5%）［1］。Argiris等［4，5］在使用培美曲塞联合西妥昔单抗或贝伐单抗治疗头颈癌时，发现MTHFR基因多态性与化疗毒性和疗效的关系不明显。但本研究结果显示，携带C677T基因野生型（CC）者ORR为35.7%，纯合突变型（TT）ORR为15.4%，杂合突变型（CT）无有效病例。CC型患者的疗效显著高于TT型和CT型者，考虑携带MTHFR基因C677T野生型（CC）的肺腺癌患者可能是使用培美曲塞联合卡铂化疗有效的优势人群。二线使用GEM/NDP和DOC/NDP方案者，化疗有效率无差别，考虑MTHFR基因C677T多态性与GEM或DOC的含铂两药方案的疗效可能无关，但该研究病例数太少，有待于进一步研究。

有研究显示，具有MTHFR基因C677T的TT型肺癌患者使用含培美曲塞方案治疗后的无肿瘤进展生存期（PFS）和总生存期（OS）显著长于含CC型、CT型患者，认为MTHFR基因C667T多态性可预测培美曲塞治疗肺癌患者生存期的差别［6，7］。本研究结果显示，具有MTHFR基因C677T CC型患者使用培美曲塞联合卡铂方案治疗后的TTP显著长于TT型和CT型者。Alberola等［8］的研究结果认为具有MTHFR基因C677T CC型患者使用吉西他滨联合顺铂治疗后的TTP显著长于TT型和CT型者，而本研究显示MTHFR基因C677T多态性与GEM或DOC含铂类两药方案的TTP可能无关。

综上，本研究结果显示，具有MTHFR基因C677T野生型（CC）多态的肺腺癌患者可能是使用培美曲塞联合卡铂化疗有效的优势人群，具有MTHFR基因C677T CC型患者的化疗疗效显著高于TT型和CT型者，TTP显著长于TT型和CT型者。MTHFR基因C677T多态性与吉西他滨/奈达铂或多西紫杉醇/奈达铂化疗疗效无关。

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［2013-07-19收稿］［2013-09-30修回］［编辑 阮萃才］

Correlation of methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR）C677T polymorphism and chemotherapy efficacy in lung adenocarcinoma

DONG Cui-mei，KANG Ma-fei，ZHAO Yan-yi，LI Jing，TAO Li-ying（Department of Medical Oncology，Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001，P.R.China）

Objective To investigate a possible correlation between C677T polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR）gene and chemotherapy efficacy in patients with pulmonary adenocarcinoma.Methods Peripheral blood samples from 92 patients with pulmonary adenocarcinoma were collected before chemotherapy，and the C677T polymorphism was genotyped using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）.We examined whether genotype correlated with whether the patients showed partial response（PR），stable disease（SD）or progressive disease（PD）following chemotherapy.Results Of the 92 patients，56（60.9%）had wild-type genotype（CC），13（14.1%）were homozygous mutant（TT），and 23（25.0%）were heterozygous mutant（CT）.Among the patients treated with pemetrexed/carpoplatin as first-line regimen，CC patients showed an overall response rate（ORR）of 35.7%，with 20 CC patients achieving PR；19，SD；and 17，PD.Among TT patients，ORR was 15.4%，with 2 patients achieving PR；7，SD；and 4，PD.Among CT patients，ORR was 0，with 13 achieving SD and 10，PD.ORR was significantly higher in CC patients than in TT or CT patients（P=0.001）.In addition，CC patients showed significantly longer time to progression（6.2 months）than did TT or CT patients（4.7 months；P=0.023）.Among the patients treated with gemcitabine/nedaplatin or docetaxel/ nedaplatin as second-line regimen，2 CC patients showed PR；5，SD；and 10，PD.3 TT patients achieved SD；among CT patients，1 achieved PR，2 SD and 7，PD.ORR was similar between CC and TT/CT patients（P=1.000）.Conclusions Pemetrexed in combination with carboplatin may be associated with greater therapeutic efficacy and longer time to progression in CC patients than in TT/CT patients.However，genotype at the MTHFR C677T polymorphism does not appear to influence the therapeutic efficacy of gemcitabine/ nedaplatin or docetaxel/nedaplatin.

Lung neoplasms；Non-small cell lung cancer；Methylenetetrahydrofolate reductase；Gene polymorphism；Chemotherapy

R734.2

A

1674-5671（2014）01-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.08

广西卫生厅自筹科研课题（Z2012426）

康马飞。E-mail：kmfgl@163.com