APP下载

四跨膜蛋白CD151在胃癌组织中表达的临床意义

2014-06-19翁文霞张金金黄幼生薛逢贵罗志飞佘梓宏解娜

海南医学 2014年21期
关键词:膜蛋白阳性细胞引物

翁文霞,张金金,黄幼生,薛逢贵,罗志飞,佘梓宏,解娜

(海南医学院病理教研室海南医学院附属医院病理科,海南海口570102)

·临床病理·

四跨膜蛋白CD151在胃癌组织中表达的临床意义

翁文霞,张金金,黄幼生,薛逢贵,罗志飞,佘梓宏,解娜

(海南医学院病理教研室海南医学院附属医院病理科,海南海口570102)

目的 探讨四跨膜蛋白CD151过表达与胃癌进展的关系。方法收集胃癌组织蜡块及手术标本,应用免疫组化SP法及RT-PCR的方法检测CD151在胃癌组织中的表达情况。结果CD151在胃癌组织、肠化生、修复性胃黏膜上皮中表达;CD151在肠型胃癌组织中的表达明显高于弥漫型胃癌(28/52 vs 25/71,P=0.045);在发生转移的胃癌组织中,CD151的表达强度高于未发生转移的胃癌组织(12/42 vs 41/81,P=0.022);在Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织中的表达要强于Ⅰ、Ⅱ期胃癌(22/64 vs 31/59,P=0.047)。与年龄、性别、部位没有明显关系(P>0.05)。结论CD151在胃癌组织中过表达,与胃癌的Lauren分型、转移及分期相关。

胃癌;CD151;转移;分期

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,绝大多数胃癌患者的死亡与胃癌的侵袭、转移、复发相关,抑制胃癌侵袭、转移、复发是提高患者生存率的重要途径,研究胃癌侵袭、转移、复发的分子机制对判断胃癌预后具有重要意义[1]。

CD151是四跨膜蛋白超家族(TM4SF)的重要成员之一,在人体细胞中广泛表达,包括上皮细胞、心肌细胞、雪旺氏细胞、血小板等。其功能广泛,如调节细胞生长、迁移和粘附等[2]。目前已经证实CD151与前列腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、肝癌等转移、复发相关[3-6],CD151在肿瘤组织中表达越高,患者肿瘤的转移率越高,预后越差,有学者认为其可作为肿瘤预后的一新指标[3-7]。

目前已经证实CD151在胃癌组织中存在过表达,部分学者认为CD151过表达可能与胃癌的转移、分化、TNM分期相关[8-9]。文献报道中的数据部分不一致[10],为进一步证实CD151表达与胃癌发生发展的关系,我们扩大胃癌标本量,从基因及蛋白水平上进一步验证。

1 材料与方法

1.1 材料收集海南医学院附属医院病理科2008-2013年档存胃癌及其配对正常胃黏膜组织蜡块123例(其中30例含胃癌转移灶,15例含有新鲜胃癌及其配对组织),均为胃大部或全切手术标本,有完整病史资料,具体信息见表1。所有病例均经病理确诊,显微镜下选择有代表性的区域进行标记、取材、制作芯片。

1.2 试剂CD151多克隆抗体购自Abcam公司,PV-9000通用型二步法免疫组化检测试剂盒、3,3-二氨基联苯胺(DAB)显色液均为福州迈新生物有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学SP方法切片常规脱蜡、水化后30%H2O2-甲醇封闭内源性过氧化物酶5 min,(pH 6.0)高压修复10 min,一抗4℃冰箱过夜,第2天切片恢复室温后二抗室温各孵育20 min,DAB显色,苏木精衬染。以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3.2 组织芯片制作根据实验研究的目的和需要,受体蜡块设计为18×12点阵。光镜下选择HE标本中适宜的样本位置,对照相应的供体蜡块,每个标本取两点。把各组样本的点阵按顺序排放,设阵列孔的左上方第一排第一个孔为空白标记,以免混淆方向。320个蜡块制作成4个组织芯片。组织芯片制作具体操作步骤见应用文献[11]。

1.4 结果判定免疫组织化学阳性产物呈棕褐色颗粒状,位于细胞膜和(或)细胞质,采用半定量积分法判定结果:显色度按细胞着色深浅计分(0分基本无着色;1分浅黄;2分浅棕色;3分为深棕色)。根据阳性细胞所占百分比计分,无阳性细胞为0分;阳性细胞<20%为1分;阳性细胞20%~50%为2分;阳性细胞>50%~75%为3分;阳性细胞>75%以上为4分。两种分值相乘若>3,则为强阳性表达。芯片中每例二个点阵取平均值记为该例分值。

1.5 RT-PCR检测组织总RNA提取参照Trizol试剂盒说明书进行操作;CD151引物由Primer 6.0引物设计软件进行设计,选择最佳引物,引物序列为5'-ATGGGTGAGTTCAACGAGAAG-3'(上游引物),5'-TCAGTAGTGCTC CAGCTTGAG-3'(下游引物);选取GAPDH基因作为内参照基因,引物序列5'-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'(上游引物),5'-GTAGAGGCAGGGATGATG TTC-3'(下游引物)。反应体系参照二步法反应试剂盒说明书,PCR产物电泳后经凝胶图像分析仪进行积分吸光度分析并摄像。反应条件为:94℃45 s,53℃40 s,72℃45 s,30个循环,最后一次循环结束后,72℃延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下分析PCR结果。拍照后用图像分析仪分析目的带和GAPDH的灰度,并计算两者的比值。

1.6 统计学方法应用SPSS18.0软件,临床病理参数间的比较采用四格表χ2检验或Fisher确切概率计算;各因素相关关系,采用Spearman等级相关分析,显著性检验水准α值等于0.05。

2 结果

2.1 CD151在胃癌组织中的表达情况免疫组化染色显示CD151在正常胃黏膜组织中局灶阳性表达,修复性上皮表达较强;82.1%(101/123)胃癌组织CD151阳性表达,表达率明显高于配对胃黏膜组织(56/123,P<0.01);肠型胃癌组织100%(52/52)阳性表达,53.8% (28/52)强阳性表达,明显高于弥漫型胃癌组织(69.0%阳性表达,39%强阳性表达,P=0.045)。CD151在胃癌组织中的具体表达情况见表1及图1。RT-PCR显示,在胃癌组织中CD151mRNA扩增强度明显高于配对正常胃黏膜组织(P<0.01),见图2。

表1 CD151在胃癌组织中的表达情况(例)

2.2 CD151表达与胃癌转移的关系CD151未转移胃癌组织强表达率为28.6%(12/42),在转移的癌组织中强表达率为50.6%(41/80),两者比较差异有统计学意义(P=0.022)。原发灶呈弱表达CD151的胃癌组织中,在转移灶中的表达明显增强;个别弥漫性胃癌组织,原发灶CD151表达缺失,但在转移灶中呈弱或中等强度的阳性(见表1及图3)。

图1 CD151在胃癌组织中的表达

图2 CD151在胃癌组织中表达的琼脂糖凝胶电泳图

图3 CD151在转移灶中的表达

2.3 CD151表达与胃癌分期的关系CD151的表达随胃癌的进展表达逐渐增强,在Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织中的表达要明显强于Ⅰ、Ⅱ期胃癌(22/64 vs 31/59,P=0.047)。

3 讨论

四跨膜蛋白超家族(TM4SF)是近年来被广泛研究的一个跨膜蛋白家族,在人体细胞中广泛表达。这个家族的成员参与细胞表面分子之间的连接信号传导,在调节细胞增殖、激活以及细胞粘附活力中起重要作用。研究证明,TM4SF家族在肿瘤的生长、迁移及血管生成中起重要的作用[2,7]。迄今为止,该家族已检测出30多个成员,其中绝大多数被认为是抑癌基因,例如CD9、CD82。它们的产物与肿瘤发展、预后呈负相关。

研究表明,CD151是TM4SF超家族中唯一的癌基因,在人类多种肿瘤细胞表面均有较高水平的表达,与肿瘤的组织分化及淋巴结转移显著相关[7],与恶性肿瘤的预后、进展、治疗等有密切的关系;随着癌的进展,CD151的表达增加,患者预后变差[2-7]。并且研究证实,CD151对内皮细胞的移行及微血管形成起促进作用,在血管生成及重塑中起关键作用,有利于肿瘤细胞的浸润及转移[12],CD151与肿瘤发展呈正相关,促进肿瘤细胞增殖、浸润及转移,在肿瘤恶性进展中起着重要的作用。

部分研究显示,CD151在胃癌组织中也存在着高表达。国内的研究显示,CD151过表达与肿瘤的分化、分期等密切相关,认为肿瘤分化越低,CD151表达越高[8-9]。最近,Sang等[10]的研究显示,在胃癌组织中CD151的过表达与胃癌的Lauren分类及进展相关,他们的数据显示CD151的过表达与胃癌的分化相关,但不是正相关,而是负相关。

我们的实验结果也显示CD151在胃癌组织中的高表达与胃癌的分期、转移相关;我们发现CD151的表达随分化程度的降低而表达减少,在弥漫性胃癌中表达要低于肠型胃癌。有意思的是我们实验中发现在肠化的胃黏膜腺体呈现CD151的强阳性表达,这点可能预示CD151的过表达与肠型胃癌的发生发展有密切的关系。

出现结果的不一致性可能与研究者选用的抗体型号、技术方法、标本量等有关。为避免相类似情况的出现,我们采用组织芯片技术、自动免疫组化、大样本、不同公司抗体进行本次实验。

组织芯片技术与传统的病理学技术方法相比,有高通量、高效性的优点,同时组织芯片因其体积小,采用同一标准选材、操作和判定结果,所得结果均一可靠,实验误差小[11]。本次实验,组织芯片中的石蜡组织都处在相同条件、同时进行实验,把实验误差控制在最小。我们实验结果多次重复进行,采用不同公司CD151抗体进行染色,结果显示,除个别病例阳性程度出现表达的偏差,绝大多数结果一致。

综上所述,我们认为CD151在胃癌组织中存在过表达,在肠型胃癌及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期胃癌组织中表达增强,与胃癌的转移、TNM分期、lauren分型相关。

[1]徐光炜.胃癌治疗的现状及问题[J].外科理论与实践,2003,8(1): 3-6.

[2]Testa JE,Brooks PC,Lin JM,Quigley JP.Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin(PETA-3/CD151)as an effector of human tumor cell migration and metastasis[J].Cancer Res,1999,59:3812-3820.

[3]Huang XY,Ke AW,Shi GM,et al.Overexpression of CD151as an adverse marker for intrahepatic cholangiocarcinoma patients[J].Cancer,2010,116:5440-5451

[4]Ke AW,Shi GM,Zhou J,et al.Role of overexpression of CD151and/ or c-Met in predicting prognosis of hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology,2009,49:491-503.

[5]Suzuki S,Miyazaki T,Tanaka N,et al.Prognostic significance of CD151expression in esophageal squamous cell carcinoma with aggressive cell proliferation and invasiveness[J].Ann Surg Oncol, 2011,18:888-893.

[6]Kwon MJ,Park S,Choi JY,et al.Clinical significance of CD151overexpression in subtypes of invasive breast cancer[J].Br J Cancer.2012,106:923-930.

[7]Sadej R,Grudowska A,Turczyk L,et al.CD151in cancer progression and metastasis:a complex scenario[J].Lab Invest,2014,94(1): 41-51.

[8]赵亚刚,张小瑞,张宏斌,等.胃癌组织中Livin及CD151的表达及意义[J].实用医学杂志,2010,26(22):4107-4109.

[9]王康磊,刘绪舜,王峰,等.四跨膜蛋白分子CD151在胃癌组织中表达及其与临床病理特征的关系[D].2012,安微科技大学.

[10]Ha SY,Do IG,Lee J,et al.CD151overexpression is associated with poor prognosis in patients with pT3 gastric cancer[J].Ann Surg Oncol,2014,21(4):1099-1106.

[11]Wu YB,Huang YS,Xu YP,et al.A High Level of TM4SF5 Is Associated with Human Esophageal Cancer Progression and Poor Patient Survival[J].Dig Dis Sci,2013,58(9):2623-2633.

[12]Lan RF,Liu ZX,Liu XC,et al.CD151promotes neovascularization and improves blood perfusion in a rat hind-limb ischemia model[J]. J Endovasc Ther,2005,12(4):469-478.

R735.2

B

1003—6350(2014)21—3245—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1273

2014-06-03)

国家自然科学基金项目(编号:81260321);海南省自然科学基金项目(编号:811206);国家大学生创业创新项目及海南省大学生创新性实验项目(编号:201211810076,HYCX201104)

黄幼生。E-mail:hys768811@163.com

猜你喜欢

膜蛋白阳性细胞引物
DNA引物合成起始的分子基础
高中生物学PCR技术中“引物”相关问题归类分析
SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
干扰素诱导跨膜蛋白抑制小儿流感病毒作用及其机制研究
火炬松SSR-PCR反应体系的建立及引物筛选
大口黑鲈鳃黏液细胞的组织化学特征及5-HT免疫反应阳性细胞的分布
EB病毒潜伏膜蛋白1基因多态性与NK/T细胞淋巴瘤的相关性
梅毒螺旋体四种膜蛋白克隆重组表达和ELISA法建立的应用研究
人胎脑额叶和海马中星形胶质细胞的发育性变化
人胎脑额叶和海马中星形胶质细胞的发育性变化