1株代尔夫特菌的分离鉴定及其对水稻丁草胺药害的修复效果

程小梅，彭亚军，周小毛，罗坤，柏连阳

(1.湖南省农业科学院 a.园艺研究所；b.植物保护研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南农业大学农药研究所，湖南 长沙 410128)

丁草胺(美国孟山都公司产品)选择性强、杀草活性高，近年来一直是中国水稻田使用面积广、施用量大的酰胺类除草剂[1]。尽管丁草胺属于非长残效除草剂，但在土壤中的残留期有1个月以上，在植株、土壤以及水体中的大量沉积，使得丁草胺药害问题频频发生[2]。解除丁草胺在土壤中的残留和污染研究成为热点[3]。土壤中的除草剂残留主要通过物理、化学及生物学降解完成。生物修复是利用微生物的广泛代谢途径对污染物进行处理，微生物降解农药，既高效安全，又运行成本低，高效降解菌的筛选尤为关键[4–5]。笔者通过富集培养技术，从农药厂排污口、废液池等长期受丁草胺污染的土壤中，分离得到1株以丁草胺为唯一碳源生长的细菌C–5，研究了其在不同条件下的生长和降解特性，及其对室内盆栽水稻药害的修复效果，以期为丁草胺药害的生物修复提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

选用江苏常隆化工有限公司农药厂长期排放丁草胺的排污口、废液池土壤作为富集培养的土壤来源。

无机盐培养基：FeSO4·7H2O，0.02 g；CaSO4，0.08 g；MgSO4·7H2O，0.4 g；K2HPO4，0.2 g；(NH4)2SO4，0.2 g，1 000 mL 去离子水，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌30 min。

LB培养基：牛肉膏10 g，蛋白胨5 g，氯化钠10 g(固体培养基加琼脂15 g)，1 000 mL去离子水，pH7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.2 方 法

1.2.1 降解菌的筛选

取5 g土样，加入含50 mg/L的丁草胺无机盐培养液中，于 30 ℃恒温摇床黑暗振荡培养(150 r/min)，每隔7 d接种体积分数5%的菌液至同样的新鲜培养基中，并且使丁草胺的质量浓度以 50 mg/L的梯度递增，至培养基中的丁草胺质量浓度达到200 mg/L，驯化约2个月。于LB培养基上划线分离，挑取生长较好的菌落分离纯化3次，得到单一的菌株，保存于LB固体斜面培养基上，30 ℃培养过夜后放置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 降解菌的鉴定

1) 降解菌的形态和生理生化特性鉴定。根据《常见细菌系统鉴定手册》[6]进行。

2) 降解菌的16S rDNA序列测定。提取细菌总DNA[7]，采用细菌的16S rDNA通用引物[8]，引物F：5′–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3′，引物 R：5′–GGTTACCTTCT TACGACTT–3′。以提取的总DNA为模板，对筛选菌株的16S rDNA 进行PCR扩增，反应体系为：10×EX–Taq Buffer 2.5 μL，dNTP mix(25 mmol/L)2 μL，16S rDNA 引物(10 mmol/L)各0.4 μL，EX–Taq酶0.2 μL，基因组DNA模板1 μL，补水到总体积25 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性 6 min，94 ℃变性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸3 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物应用胶回收试剂盒纯化回收(GENEray)，回收片段连接到pEASY T5，热激30 s转化到Top10感受态细胞，在含有50 μg/mL的LB固体培养基上37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆斑于含有氨苄青霉素的液体LB培养基中培养12 h，应用M13F/R进行菌液 PCR验证后测序，测序结果在 NCBI上进行BLAST分析同源性，并采用MEGA5.05构建系统发育图谱。

1.2.3 降解菌的降解条件优化

1) 丁草胺的提取及色谱条件。将20 mL接种了菌体的无机盐培养基转入125 mL分液漏斗中，分别用20、20、10 mL乙酸乙酯振荡提取3次，有机相经无水硫酸钠(350 ℃烘干4 h)过滤至浓缩瓶，在旋转蒸发仪浓缩至近干，冷却后加丙酮振荡淋洗定容至10 mL，摇匀待测。

丁草胺的气相色谱条件：气相色谱仪为岛津2010，色谱柱为 RTX–5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)[9]。2)考查环境pH和接种量对菌株生长及对丁草胺降解效果的影响。分别以接种量1%、5%、10%、15%、20%作为菌悬液添加量；分别以pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的0.1 mol/L配制的无机盐培养基培养，150 r/min摇床30 ℃培养7 d，测定细菌的OD600值和对丁草胺的降解率[10]。

1.2.4 降解菌修复丁草胺对水稻幼苗药害的盆栽试验

pH7.0缓冲液配制的半固体无机盐培养基灭菌后，分别添加丁草胺至质量浓度为5、10、20 mg/L，接种量5%、10%(OD600=1.34)，组合处理。菌液于室温下12 000 r/min离心8 min，用无菌水洗脱菌体沉淀后加入培养基中。将培养基放置于培养箱中过夜后，将萌发一致的水稻种子移栽至盆中，每盆10粒，每个处理设3个生物学重复。于培养箱中16 h光照、8 h黑暗、30 ℃培养，5 d后观察记录出苗数、株高、根长、鲜重。

2 结果与分析

2.1 降解菌的筛选及鉴定结果

通过富集培养和对降解单菌株的分离和纯化，筛选出能以丁草胺为唯一碳源的单一菌株，将分离得到的单一菌株重新转接到含有丁草胺20 mg/L的无机盐培养基中，摇床培养验证其降解丁草胺的特性。通过测定各单一菌株的降解率，C–5菌株的降解率最高。

C–5菌株在LB平板上放置于培养箱30 ℃培养24 h后，菌落乳白色，呈隆起、圆形、不透明状。菌体形态经扫描电镜(SEM)观察，大多以短链状存在，只有少数以单个存在，如图1所示。

C–5菌株淀粉水解反应呈阴性、接触酶反应呈阳性、脲酶反应呈阳性、V–P反应阳性、甲基红反应阳性、氧化酶反应阳性、明胶液化反应阳性。

降解菌株C–5序列已在GenBank中注册，登录号为KC702840。将C–5菌株的16S rDNA序列与GenBank中的同源性较高的4个细菌模式株进行比较，菌株 C–5的 16S rDNA 序列与代尔夫特菌属(Delftia sp.)的4个种都有较高的序列同源性，构建其系统发育树，如图2。C–5菌株的16S rDNA与Delftia tsuruhatensis (GenBank登录号为GQ140326)，Delftia acidovorans (GenBank登录号为GU459215)，Delftia lacustris(GenBank登录号为JN644603)及Delftia sp.(GenBank登录号为FJ688376)的相似性均为99%，且与Delftia sp.的几个种共同组成1个分支。

根据系统发育树的结果，结合生理生化特征，将C–5菌株鉴定为代尔夫特菌属(Delftia sp.)。

图1 菌株C–5在扫描电镜下的菌体形态Fig.1 Cell morphology of strain C–5 under scanning electron microscope

图2 C–5菌株的系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree for strain C–5

2.2 C–5菌株的降解特性

2.2.1 pH对 C–5菌株生长和对丁草胺降解效果的影响

当 pH=7时，C–5菌株的生长状态最好，在强酸或者强碱状态下都不利于细菌生长(图3)。当pH=7时，C–5菌株对丁草胺的降解率最高，偏酸或偏碱都影响细菌对丁草胺的降解能力。

图3 C–5菌株在不同pH的生长量及对丁草胺的降解率Fig.3 Influence of strain C–5 on growth and butachlor degradation under different pH

2.2.2 接菌量对 C–5菌株生长和对丁草胺降解效果的影响

由图4可看出，随着接菌量的增加，细菌的生长量也随之增加。在接菌量为5%时，细菌对农药的降解率最高。随着接菌量的增大，降解率增幅不大，当接菌量达到20%时，降解率反而会下降，这可能是由于细菌量过大而产生了某些有害中间代谢产物，抑制了有效降解菌的生长的缘故。

图4 C–5菌株在不同接种量的生长量及对丁草胺的降解率Fig.4 Influence of strain C–5 on growth and butachlor degradation with different inoculation size

2.3 C–5菌株在最佳培养条件下的生长量和对丁草胺的降解能力

由图5可知，C–5菌株的生长量在第7天时达到最大值，其生长趋势趋于平缓，对丁草胺的降解在第7天也达到最大。说明随着C–5对培养基的适应和生长，对丁草胺的降解能力也愈来愈强，并同时在第7天达到最大。在培养的第1天降解率虽然不高，但是丁草胺的浓度也下降了。同时该菌株生长比较快，在第1天就能生长良好，说明笔者对无机盐培养基的优化比较成功。

图5 C–5菌株的生长及其对丁草胺的降解效果Fig.5 Growth curve of strain C–5 and degradation curve of butachlor with strain C–5

2.4 C–5菌株对水稻丁草胺药害的修复效果

由表1可知，添加C–5菌株后对产生丁草胺药害水稻的出苗率、株高、根长、株鲜重均有比较明显的修复效果。在丁草胺质量浓度为 5 mg/L、接菌量为10%(OD600nm=1.34)时，出苗率达到87%，仅比空白低 10%，比未加菌组高 50%。株高比空白低 44%，比未加菌高 93%，对药害的修复效果最好。此外在丁草胺质量浓度10、20 mg/L下的修复效果虽然都不理想，但在10%接菌量下仍有一定的修复效果。

表1 C–5菌株不同接种量下的水稻药害植株性状Table 1 Character of butachlor injured rice inoculated with different amount of strain C–5

3 讨 论

从长期受丁草胺污染的农药厂排污地筛选到的代尔夫特菌属的细菌 C–5，对丁草胺具有较好的降解能力，且能以丁草胺为唯一C源。通过富集驯化、生理生化特征和菌株形态相似性比较及 16S rDNA序列同源性分析，将菌株C–5鉴定为代尔夫特菌属(Delftia sp.)。目前有学者在(2,4–D)[13]、苯胺[14]等中筛选出该菌属。国内外报道的对丁草胺其降解作用的微生物主要有钩杆菌属[15]、不动杆菌属[16]、施氏假单孢菌[17]、副球菌属(Paracoccus sp.)[18]、红球菌属(Rhodococcus sp.)[19]等，本研究筛选出的代尔夫特菌属的细菌，丰富了丁草胺降解菌株的多样性，为受丁草胺污染的土壤的生物修复提供了菌株资源。

盆栽试验表明，通过接种降解菌，能明显减轻丁草胺对水稻植株的药害。在丁草胺质量浓度为5 mg/L，接菌量为10%的条件下，对丁草胺的药害修复效果最好，修复后出苗率达 87%，总体修复效果达 50%以上。在验证了室内盆栽药害修复效果后，还将进一步探索该菌株的最适发酵条件，配制高效发酵液投入大田，在自然环境下验证药害修复效果。

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