猪链球菌病的诊断与药敏试验

林喜爵

（东兴市东兴镇水产畜牧兽医站，广西东兴 538199）

猪链球菌病的诊断与药敏试验

林喜爵

（东兴市东兴镇水产畜牧兽医站，广西东兴 538199）

本试验采取流行病学调查、临床表现、病理剖检、现场诊断、实验室生化鉴定等方法对东兴市某2个猪场的发病猪进行诊断，选取6例疑似为猪链球菌感染的病猪进行采样、分离、培养，通过实验室生化试验、动物致病性试验等系统鉴定，确诊为猪链球菌Ⅱ型，并通过药敏试验，最终确定猪链球菌病毒对头孢菌威和环丙沙星高度敏感，对青霉素和卡那霉素中度敏感，而对土霉素、链霉素、庆大霉素为耐药性，从而为临床应用提供了科学的方法。

链球菌；药敏试验；生化鉴定

猪链球菌病是由几种不同的血清型链球菌感染所引起的多种病症的总称，是猪的一种常见病。急性的通常表现为出血性败血症和脑炎，慢性的以关节炎、心内膜炎、化脓性淋巴节炎为特征。

1 材料和方法

1.1 试验药品与器材

1.1.1 病料

来自东兴市3个猪场的疑似链球菌病料1# 2# 3# 4# 5# 6#。分别取于心血、肝、脾、肺及肠系膜淋巴结等。

1.1.2 培养特性用培养基

普通琼脂平板 鲜血琼脂平板 麦康凯琼脂培养基均是自行配置。

1.1.3 试验药物

青霉素 土霉素 环丙沙星 链霉素庆大霉素 卡那霉素 头孢菌素。

1.1.4 试验动物

健康小白鼠（30～50g）10只。

1.2 方法

1.2.1 涂片镜检

无菌采集急性死亡的病猪心血、肝、肺、脾及肠系膜淋巴结等病料，制作肝、脾脏的触片，用关节液、心血涂片，干燥、火焰固定后进行革兰氏染色镜检。

1.2.2 细菌分离培养

无菌采集的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结关节液等病料分别划线接种鲜血琼脂平板，37 ℃培养24 h后，挑取平板上表面光滑、灰白透明单个可疑菌落接种于THB肉汤做纯培养，37 ℃培养24 h后，进行革兰氏染色，镜检。

1.2.3 生化试验

用分离菌纯培养物进行乳糖、蔗糖、山梨醇、棉子糖、葡萄糖、甘露醇、木糖等生化试验。

1.2.4 培养特性

取单个保存好菌落分别在普通琼脂平板 鲜血琼脂平板麦康凯琼脂培养基上进行培养及65 g/L的Nacl和pH 9.6的生长耐性试验。24h后观察。

1.2.5 动物致病性实验

健康小白鼠10只，随机分为两组，每组5只，其中实验组腹腔注射上述肉汤培养物0.5ml/只；另外一组注射无菌生理盐水1ml/只做对照。观察其死亡和发病情况。

1.2.6 药敏试验

在超净台中，用经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），对药敏片进行标记，将平皿培养基置于37℃温箱中培养24h后，观察效果。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查

2013年2月广西东兴市某2个猪场仔猪突然发生死亡，母猪病初体温升高，关节肿胀，不能站立，有时出现神经症状。母猪病2头，育肥猪发病4头，仔猪发病28头，总共发病230头，死亡5头。其发病率为12%，死亡率为14.7%。该两个猪场的饲养管理较为混乱，曾使用过猪瘟疫苗、链球菌疫苗、蓝耳疫苗进行防疫。发病后用多种抗生素和磺胺类药物治疗，效果不佳。

2.2 临床表现

母猪表现为精神沉郁，体温升高达43℃，出现稽留热，食欲不振，眼结膜潮红，流泪，鼻腔中流出浆液性或脓性分泌物，呼吸急促，耳廓、腹下及四肢下端皮肤呈紫红色，有出血点，出现跛行，病程稍长，多在1～3d内死亡。哺乳仔猪和断奶仔猪，主要表现为神经症状，如运动失调、盲目走动、转圈、空嚼、磨牙、仰卧，后躯麻痹，侧卧于地、四肢划动，似游泳状，病程短的几小时，长的1～5d，致死率极高。个别猪在颌下、咽部、颈部等处的淋巴结化脓和形成脓肿，病程3～5周。

2.3 病理剖检

剖检可见鼻黏膜紫红色、充血及出血，喉头、气管充血，常有大量泡沫。肺充血肿胀。全身淋巴结有不同程度的肿大、充血和出血。胃和小肠黏膜有不同程度的充血和出血，肾肿大、充血和出血。个别脑膜下积液，脑组织切面有点状出血。关节腔内有黄色胶胨样或纤维素性、脓性渗出物，淋巴结脓肿。有些病例心瓣膜上有菜花样赘生物。

2.4 实验室检查结果

2.4.1 涂片镜检

将疑似病料涂片革兰氏染色后镜检，发现病料中含有大量的呈3～6个左右的短链、个别单个排列的球菌。

2.4.2 实验室生化试验结果

项目蔗糖山梨醇乳糖葡萄糖麦芽糖甘露醇淀粉1#++++++-2#++++++-3#++++++_ 4#++++++-5#++++++-6#++++++-

判定标准：+示大多数（90～100%）菌株为阳性，“-”表示大多数（90～100%）菌株阴性

2.4.3 培养特性

分离菌为兼性厌氧菌，无运动性：在普通营养琼脂平板上生长极贫瘠，培养2 4 h后仅在划线处见有针尖大小的菌落；血清肉汤中血清肉汤浑浊，不形成菌膜，培养48 h后上清较透明。在麦康凯琼脂平板上不生长。生理特性是在PH=9.6肉汤中经30min后移植到鲜血琼脂平板上仍能继续生长，在pH=9.6的葡萄糖肉汤中生长表现为上液澄清，在6.5%NaCl中生长状态为均匀浑浊。

2.4.4 动物致病性结果

实验组5只小白鼠在接种后36-84h呈现不同症状的变化，其中2只分别于48h、72h后死亡。另外3只表现为食欲减退、精神沉郁，额下淋巴结肿胀。剖检死亡小白鼠发现其肝、脾、肾肿大，膀胱高度充盈，胸腔积液，心冠脂肪出血。剖检未死亡小白鼠发现其肾脏充血肿大，胃和小肠黏膜有不同程度的充血和出血。无菌采取心血及胸腔积液涂片，革兰氏染色镜检，发现有大量单个、个别呈4-6个左右的短链革兰氏阳性球菌。对照组临床症状和剖检均未见异常现象。

2.4.5 药敏试验结果

注：抑菌直径小于10mm为耐药，10～15的为中度敏感，大于15mm的为高度敏感

结果表明：敏感的药物依次是：头孢菌威和环丙沙星。中度敏感的是青霉素和卡那霉素，而对土霉素、链霉素、庆大霉素为耐药性。此为临床用药提供了科学依据。

3 讨论

综合临床诊断、分离菌株的形态染色特性、培养特性、生化特性及动物实验，确诊本次病原为链球菌。猪链球菌极易产生耐药性，应该采取药敏实验选出敏感药物进行治疗，方能起到较好的效果。本次药敏试验结果表明猪链球菌病毒对头孢菌威和环丙沙星高度敏感，对青霉素和卡那霉素中度敏感，而对土霉素、链霉素、庆大霉素为耐药性。分群鉴定链球菌的方法有血清学试验和生化试验。其中血清学试验比较简单可靠，但标准阳性血清不易获得；生化试验只能鉴定到群，无法进行定性鉴定。猪场应建立健全严格的消毒制度，一旦发现病猪应隔离治疗；对病死猪做无害化处理以防病原扩散；对被病原污染的圈舍、场地、用具等进行严格消毒。预防本病的疫苗很多主要分为灭活苗和亚单位疫苗两种类型。由于本菌血清型多，不同血清性菌株之间交叉免疫性又不强，因此灭活苗主要从当地分离菌株制备而成，对母猪和2月龄猪进行免疫接种，能有效控制本病的发生。此外，对无病猪场应防止引进带菌猪，引进前进行血清学试验进行检疫，对感染猪场逐头进行检疫，清除阳性带菌猪。

4 小结

本实验从流行特点、病理变化、临床症状等方面进行研究，并通过生化试验、细菌培养进行鉴定，从多个方面进行阐述，并对病猪进行采样、分离、培养，通过培养特性、菌体形态、菌落形态、染色特性、生化试验、动物致病性试验等系统鉴定，确诊为猪链球菌2型，通过药敏试验，确定链球菌对头孢菌威、环丙沙星、青霉素、卡那霉素、土霉素、链霉素、庆大霉素的抑菌直径平均值为15.25mm、18.9mm、13.07 mm、12.2mm、7.9mm、7.07mm、7.77mm。最终确定链球菌对头孢菌威和环丙沙星最为敏感，对土霉素、链霉素、庆大霉素为耐药性，从而为临床用药提供了科学依据。