奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

刘明春

（广西柳州畜牧兽医学校，广西柳州 545003）

奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

刘明春

（广西柳州畜牧兽医学校，广西柳州 545003）

导致奶牛隐性乳房炎的因素很多，但病原微生物是导致隐性乳房炎的主要病因[1]，其中以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，但各地病原感染情况不尽相同。本试验通过对柳州市部分奶牛场采集奶样进行细菌的分离及药敏试验，为奶牛隐性乳房炎的防治、用药提供可靠依据，以促进柳州市奶牛养殖业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 培养基的制备

普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养琼脂、营养肉汤、血清肉汤、生化培养基及试剂按常规方法配制。无菌将牛鲜血以5～7%的比例加入消毒好的30～40℃营养琼脂培养基中。各培养基分别倾注于平皿，冷却后置于冰箱备用。生化鉴定所用的微量发酵管购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.2 试剂

诊断液（LMT）：中国农业科学院中兽医研究所研制产品。革兰氏染色液：广西大学临床教学研究室提供。

1.1.3 药敏试纸纸片

青霉素、链霉素、庆大霉素、阿米卡星、林可霉素、克林霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、四环素、头孢氨苄和红霉素，购自上海市医学化验所。

其它器材：超净工作台、恒温培养箱、冰箱、高压灭菌锅、显微镜、试管等。

1.2 中药准备

方剂由黄芪、蒲公英、金银花、当归、川芎、熟地、王不留行、木芙蓉、党参、杜仲叶、山豆根、甘草等十几种中药组成，购自柳州市医药公司。按复方比例称取中药，加5～10倍水武火加热至沸后文火维持30min，四层纱布过滤。滤渣按上述方法再煎煮1次，合并2次滤液，浓缩至50ml，备用。

1.3 细菌分离培养与鉴定

选择经LMT诊断为阳性的柳州市某奶牛场的50头奶牛，每头奶牛取乳样5ml于无菌乳样杯中，作好标记，待检。每个离心管放5ml奶样，2000～3000rpm离心10min，弃去管中的上层液体，留取底部沉淀物，无菌操作吸取沉淀物0.1ml，分别接种于绵羊鲜血琼脂培养基、麦康凯琼指、营养琼脂、改良爱德化琼脂、却曼琼脂平皿，并接种营养肉汤两管（一管为营养肉汤，另一管添加10%血清），37℃培养24h，挑取菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。根据菌体形态、溶血情况及染色特性判定细菌类属[2]。各类细菌按相应生化特性作进一步鉴定[3。

1.4 药敏试验

1.4.1 西药药敏试验

选择从乳样中分离出的典型菌株－金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌分别均匀划线接种于血琼脂平皿，以纸片扩散法进行药物敏感试验。

所选抗菌药物有：恩诺沙星、诺氟沙星、庆大霉素和阿米卡星、林可霉素、克林霉素和头孢氨苄、青霉素G、链霉素、四环

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果

50个乳样全部检出了10种81个菌株，其中葡萄球菌45株，占55.56%；链球菌19株（无乳链球菌7株、停乳链球菌6株、乳房链球菌4株、乳链球菌1株、粪链球菌1株），占23.46%；大肠杆菌11株，占13.58%；克雷伯氏菌3株，占3.70%；志贺杆菌3株，占3.70%。由葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌引起的隐性乳房炎占整个比例的92.59%（表1）。单纯由某一种病原菌引起的占30%，由2～3种甚至是3种以上的病原菌引起的占占70%，混合感染的情况比较严重。

2.2 药敏试验结果

结果表明，葡萄球菌对恩诺沙星、阿米卡星和庆大霉素高度敏感，对林可霉素、克林霉素、四环素、诺氟沙星和头孢氨苄比较敏感；链球菌则对阿米卡星、克林霉素、恩诺沙星、林可霉素和庆大霉素高度敏感，对诺氟沙星、四环素比较敏感，对头孢氨苄不敏感；大肠杆菌对恩诺沙星、头孢氨苄、阿米卡星、庆大霉素和克林霉素高度敏感，对诺氟沙星、林可霉素比较敏感，对四环素不敏感。金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌分别对青霉素、链霉素、红霉素已产生耐药性。中药复方对金黄色葡萄球菌与链球菌较为敏感，而对大肠杆菌则为高度敏感（表1）。

表1 各药对3种病原菌的抑菌圈直径（mm）

3 讨论

3.1 本地区奶牛隐性乳房炎的病原

通过对50个阳性乳样进行细菌分离鉴定，共得到10种81个菌株。其中葡萄球菌的分离率最高，为55.56%，链球菌占23.46%，大肠杆菌占13.58%。说明柳州市部分奶牛场奶牛隐性乳房炎以葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主要病原菌，占92.59%。而且以素和红霉素共11种常用抗菌药。

抗菌效果判定：青霉素G和头孢氨苄对葡萄球菌的抑菌圈直径≥29mm为敏感，≤28mm为不敏感；对链球菌抑菌圈直径≥28mm为敏感，≤19mm为不敏感；其它药物抑菌圈直径≥20mm为高敏；15～20mm为中敏；≤15mm为不敏感。

1.4.2 中药抑菌试验

用平板法，取各菌液200μl均匀涂于琼脂板上，然后在平板上打孔，封底，每孔中注满药液，重复3孔，测量抑菌圈直径。2～3种病原菌感染为主，混合感染相当严重，可能这与牛场的消毒卫生管理不严有一定的关系。强化卫生意识，加强挤奶过程的各项卫生管理，改善牛舍的环境卫生，是防治奶牛乳房炎工作的重中之重。

3.2 中西药的抑菌效果

药敏试验结果表明，奶牛乳房炎的主要病原菌中绝大部分对青、链霉素和红霉素耐药，用传统的青霉素、链霉素以及红霉素疗法效果已几乎无效，但对恩诺沙星、阿米卡星和庆大霉素等敏感性较高，这可能与该场在治疗奶牛乳房炎方面较少使用这些药物，因而病原菌并没有产生较大的耐药性。同时，奶牛乳房炎的主要病原菌对中药组方敏感程度较高。因此，在以后的奶牛乳房炎的治疗中，不能单一使用某一种药物，或者过长时间使用某种药物。建议采取纯中药制剂防治奶牛隐性乳房炎。

[1] 曹访，唐修君，陈丽，等.奶牛乳房炎研究进展[J].黑龙江动物繁殖，2006，14（4）：13-15.

[2] 姚火春.兽医微生物学实验[M].北京：中国农业出版社，2002：19-66.

[3] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：77-78，261.

刘明春（1965-），男，大学本科学历，兽医专业硕士，执业兽医师，广西柳州畜牧兽医学校高级讲师，主要从事畜牧兽医专业课程教学与技术推广工作。