胶体金免疫层析法快速测定动物源食品中的呋喃唑酮代谢物残留

潘嘉慧 田 峻 沈国权 赵亮亮 朱海云

（佛山市质量计量监督检测中心，广东佛山 528225）

胶体金免疫层析法快速测定动物源食品中的呋喃唑酮代谢物残留

潘嘉慧 田 峻 沈国权 赵亮亮 朱海云

（佛山市质量计量监督检测中心，广东佛山 528225）

本研究从优化呋喃唑酮代谢物免疫抗原、包被抗原的结构及优化偶联技术角度出发，提高呋喃唑酮抗体的特异性、亲和力，并通过优化样品前处理步骤，最终得到呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条的检测低限为1.0 µg/kg，特异性好，稳定性高。

呋喃唑酮代谢物；抗原；免疫胶体金；快速检测

呋喃唑酮是硝基呋喃类广谱抗生素中最具代表性的一种，价格便宜，疗效确切，在畜禽及水产养殖上应用非常广泛[1]。呋喃唑酮在生物体内代谢速率很快，代谢化合物3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）可在体内残留达数周之久，甚至进入食物链中，在自然环境中长期残留。研究表明呋喃唑酮及其代谢物AOZ具有相当大的毒性和副作用，因而引起了人们的高度重视[2]，导致各国禁止此类药物在治疗和饲料中使用。欧盟、美国、中国等国家均将呋喃唑酮列为禁用药。尽管我国政府和相关组织对该类药物的残留给予了高度重视，但其在动物源性食品中的残留仍时有发生。

目前对呋喃唑酮代谢物的国家标准检测方法有色谱分析法[3]、免疫检测法（酶联免疫分析方法[4]）。色谱分析法（高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法）样品前处理复杂，费用高；免疫分析法具有快速、灵敏度高、高通量的特点。其中免疫分析方法有酶联免疫法、胶体金免疫层析技术等。酶联免疫分析法操作相对繁琐，对操作人员的专业知识要求较高，相比之下，胶体金免疫层析技术基于肉眼水平的检测，不需任何仪器设备和试剂，比酶联免疫法省略了加显色剂和终止液的步骤，更简化的操作，体积小，易携带，几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果，并可保存实验结果，容易在基层单位普及应用。

现有免疫检测方法均需要将样品用对硝基苯甲醛[3]、对羧基苯甲醛[4]衍生化，在AOZ检测的灵敏度和特异性还是存在缺陷，因而，有必要在现有技术上，从优化免疫抗原、包被抗原的结构及偶联技术角度出发，提高抗体的特异性、亲和力，从而增加AOZ免疫胶体金快速检测的灵敏度和特异性。

1 试验部分

1.1 材料与试剂

AOZ、氯金酸、柠檬酸三钠、6-氧代己酸、甲基磺酸、二甲基甲酰胺（Nimethylformamide，DMF）、3-磷酰化二苯酯苯并[D]噁唑-2-酮[2（3H）- Benzoxazolone，3-（diphenoxyphosphinyl）-（9CI），DPBO]、苯并噻唑硫酮（Benzothiazolethione，BTT）：国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、卵清白蛋白（Ovalbumin，OVA）：美国Sigma公司；羊抗鼠IgG、硝酸纤维素膜（NC膜）和金标垫，样品垫，PVC底板，吸水纸：上海杰一生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Avanti 高速冷冻离心机：美国Beckman公司；UV-2700紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；Ultra Genetic超纯水系统：英国ELGA公司；JY-EQ08划膜喷金一体机：上海杰一生物有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 缩醛法合成AOZ半抗原

将200ml乙醇加入到500ml的圆底烧瓶中，依次加入AOZ（图1中结构式a，10.2g，0.1mol）和6-氧代己酸（15.6g，0.12mol），加热回流3h。停止加热，自然冷却反应液至室温，静置过夜。抽滤，滤饼用乙醇洗涤（20.0ml×3），50℃干燥5h后得到20.4g含有羧基的呋喃唑酮衍生物。制备的AOZ半抗原（图1中结构式b）

1.3.2 活泼硫酯法合成AOZ免疫抗原和包被抗原

取呋喃唑酮半抗原（图1中结构式b，0.214g，1.0mmol）溶于30ml DMF中，冷却至0～4℃，搅拌下加入DPBO（0.351g，1.0mmol）和BTT（0.167g，1.0mmol），保温反应过夜。加入100ml 10%碳酸氢钠溶液和100ml水，继续搅拌1h，抽滤，滤饼用水洗涤（50mL×2）后用20ml DMF溶解为A液。称取2.0g BSA溶于200ml的浓度为1.0mol/L的PBS（pH=8）中，加入5ml DMF，在0～5℃下搅拌溶解为B液，将上述A液缓慢滴加到B液中，保温反应8h，离心取上清液，4℃下用生理盐水恒温透析3d，每天更换3次透析液，冷冻干燥后得到呋喃唑酮免疫原（图1中结构式c）。

图1 AOZ免疫抗原/包被抗原的合成路线图

1.3.3 呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备

用AOZ免疫抗原多次免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）在体外融合形成杂交瘤细胞，经选择性培养基筛选，得到阳性杂交瘤细胞株。将其注入小鼠腹腔获取腹水，或利用体外细胞培养收集培养上清液等方式，制备AOZ单克隆抗体。用硫酸铵沉淀法纯化该抗体，并与等体积甘油混合，低温保存。

1.3.4 羊抗鼠IgG的制备

以上述步骤1.3.3制备的鼠源抗体为免疫原，对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠IgG。

1.3.5 胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金：于100ml超纯水中加入1ml 1%的柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入1ml 1%氯金酸溶液，待溶液颜色变为澄清酒红色时，继续加热10min，冷却至室温后，4℃保存备用。

1.3.6 胶体金标记呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备

量取胶体金溶液10ml，将其pH值调整到7.8，搅拌并加入AOZ单克隆抗体0.8mg进行标记，持续搅拌30min后，加入20%的BSA终止反应，10000 rpm离心30min，取沉淀用金标缓冲液溶解至1ml备用。

1.3.7 胶体金免疫层析试纸条的制备和组装

使用划膜喷金一体机将制备好的金标抗体均匀喷涂到金标垫上，喷金参数4μl/cm，37℃真空干燥8h备用。将适当浓度的包被抗原（AOZ-OVA偶联物）包被到NC膜的检测线（T线）位置，羊抗鼠IgG包被到质控线（C线）位置，包膜参数1.0μL/cm，晾干备用。将干燥好的样品垫，金标垫，NC膜，吸水纸，按顺序粘贴到PVC底板上，切割成条，组装成卡，分装到铝箔袋，袋内装入干燥剂，密封保存。

1.3.8 样品前处理、检测及判读

（1）样品前处理

①鸡肉、猪肉、虾肉、鱼肉组织：取2g待测样品，用均质器充分均质后，置于50ml离心管中。加入4ml去离子水，0.5ml 1mol/ L盐酸溶液，200μL 0.01mol/L对羟基苯甲醛或邻氨基苯甲醛，涡旋震荡3min，在60℃中放置2h或超声1h。取出冷却至室温，依次加入5ml 0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液，0.4ml 1mol/L氢氧化钠溶液，5ml乙酸乙酯，涡旋振荡1min，4000r/min 离心10min，将上层乙酸乙酯层提取液取至另一洁净容器中，水相再用5ml乙酸乙酯重复萃取两次，合并乙酸乙酯层，于60℃下氮气吹干，加入1ml 正己烷涡旋震荡1min，再加入1ml 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液，涡旋震荡1 min，5000r/min离心10min，吸取下层水相溶液用于分析，或继续使用C18固相萃取柱净化。

②牛奶：取5ml待测样品于50ml 离心管中。加入250μl 0.5 mol/L亚硝基铁氰化钾（K2Fe（CN）5·NO3·H2O）水溶液，250μl 1 mol/L 硫酸锌（ZnSO4·7H2O）水溶液，涡旋震荡1min，4℃下4000 r/min离心10min，取上清液，以下步骤同上。

③蜂蜜：取2g 待测样品于50ml 离心管中，以下步骤同上。（2）样品检测

撕开铝箔包装，取出检测卡。取滴两滴检体（约75μL）于加样孔中，等待检体吸附移动至测试区中，等待5min后即可判读结果。

（3）结果判读

①阴性结果：T线比C线深或一样深，表示检品AOZ浓度低于1.0 μg/kg。

②阳性结果：T线比C线淡或几乎看不见，表示检品AOZ浓度高于或等于1.0 μg/kg（包括看不到T线）。

③无效结果：如果测试结果未出现任何色带或是C线未出现，此时表示此试剂已失效、过期或操作不当，需另做一次测试。

2 结果与讨论

2.1 AOZ半抗原、免疫原/包被原的制备

AOZ的分子较小，不具有免疫原性，需要与载体蛋白偶联后方能具有免疫原性；然而AOZ是一个化学结构上没有羧基和氨基的半抗原，它本身无法与蛋白偶联，而往往需要合成其他衍生物作为半抗原，然后与载体蛋白偶联才能成为全抗原。

本研究特别从半抗原、免疫原/包被原的结构出发，采用全新的连接臂，优化偶联技术和合成路线，同时保证检测特异性和灵敏度。本研究中的AOZ半抗原保留了AOZ的抗体识别部位：对硝基苯基部分，从远离特征结构、免疫原性最弱的羟基端引入间隔臂，提高了半抗原的免疫原性，同时保留AOZ的骨架结构，提高特异性，确保半抗原不受蛋白的屏蔽作用；引入的间隔臂具有一定的长度和适当的极性，将载体蛋白对小分子的电子排布和空间结构的影响降到最低；合成的半抗原有利于提高半抗原与载体蛋白的偶联比，并且能更好地暴露半抗原的抗原决定簇。在免疫分析中，通过对半抗原连接位点，连接臂长度，结构等进行合理选择与搭配，可以有效地利用可预测的交叉反应，达到同时检测某一族化合物的目的，并且可以抑制不可预测的交叉反应，提高检测的特异性[5]。

2.2 胶体金纳米颗粒质量评价

胶体金纳米颗粒的粒径大小与胶体金探针稳定性密切相关。将制备好的胶体金溶液经紫外-可见光分光光度计在400～700nm波长处扫描，测定吸收图谱，结果显示，胶体金溶液在525nm出现最大吸收峰，OD525nm=1.82，颗粒大小约为30nm，符合胶体金免疫层析法中胶体金颗粒大小的要求。

2.3 抗原包被浓度的优化

以AOZ标准溶液0.5μg/L进行检测，优化调整抗原的包被浓度。分别选择包被浓度为0.70，0.75，0.80，0.85mg/mL进行测试选择。取75μL AOZ标准溶液于样品孔中，溶液沿吸水纸方向移动。首先与金标垫上的金标抗体结合，并一同继续向吸水纸方向移动，到达T线区域。在T线处，溶液中的AOZ与包被抗原竞争金标抗体，溶液中的AOZ浓度一定，则包被抗原浓度越大，能够与包被抗原相结合的金标抗体的量越多，胶体金的颜色（红色）越深。随着包被浓度的增大，T线颜色越深，到0.80mg/mL达到最佳浓度，浓度再增加时颜色基本不变，因此确定最佳膜包被浓度为0.8mg/ml。

2.4 胶体金免疫层析试纸条检测AOZ的检出限

配制浓度为0.5，0.8，1.0μg/L AOZ标准溶液。取75μL标准溶液于样品垫中，层析结束后观察结果。结果表明，随着AOZ的浓度升高，在C线区胶体金颜色强度相对增大，在T线区胶体金颜色则逐渐变浅，在0.8μg /L时T线颜色明显变浅，在1.0μg/L时T线颜色完全消失。则将T线颜色基本完全消失所对应的浓度定义1.0μg/L为胶体金免疫层析法的检出限，与国家标准方法中使用色谱检测的测定低限相当[3-4]，但相比之下胶体金检测试纸条的价格等优势不言而喻，且满足欧盟2003/181/EC法令规定限量的检测要求：呋喃唑酮代谢物AOZ在猪肉和水产品中的最大允许限量（MPRL）为1.0μg /kg。

2.5 胶体金免疫层析试纸条检测AOZ的特异性

抗体的特异性是衡量抗体质量的重要指标。选取了3种AOZ结构相似物（呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林代谢物）进行特异性试验，添加浓度均为10μg/L，T线显色明显，即均为阴性，而AOZ阳性对照试液只有C线显色，T线不显色，显示为强阳性，表明本试验研制的AOZ胶体金试纸条特异性表现良好，与测试的3种类似物均没有交叉反应现象。

近年来胶体金免疫层析技术广泛应用于食品安全快速诊断领域。本研究通过优化偶联技术路线，以达到结构优化，提高抗体质量，从而进一步增加AOZ免疫胶体金快速检测的灵敏度和特异性的免疫抗原和包被抗原。本实验成功研制出AOZ快速检测试纸条，灵敏度高、特异性强、稳定性好，除了样本预处理外的测试时间仅需五分钟，与ELISA方法相比，快速、简便、成本低，可操作性强，为广大的动物源性食品加工企业、检测部分现场监测等提供了一种有效、便利的方法，值得推广。

[1] 陈杖榴.兽医药理学[M].北京：中国农业出版社，2010.

[2] Kelly B D，Heneghan M A，Connolly C E，et al. Nitrofurantoininduced hepatoxicity mediated by CD8+T cells[J]. American Journal of Gastroenterology，1998，93（5）：819-821.

[3] Chappey ON，Sandouk P，Scherrmann J G. Monochonal antibodies in hapten immunoassays. Pharmaceutical Research，1992，9（11）：1375-1379.