酶联免疫吸附分析法应用于战场水环境TNT检测的可行性研究

刘婧婷++谯华++冯孝杰++陈志莉

摘要：为了快速检测战场水环境中TNT含量以判断水源可用性，提出了建立关于TNT的酶联免疫吸附分析法（ELISA）。分析ELISA的建立要点：根据TNT分子结构官能团的可改造性提出了合成半抗原的3种方法；对应3类半抗原采用不同蛋白偶联方法合成3种人工抗原；分析动物体对TNT人工抗原可产生有效免疫应答并可获得满足ELISA要求的抗血清；样品前处理方法可满足快速检测要求。从理论证明建立TNT的ELISA并满足检测要求的可行性；同时，提出了利用此法检测待解决和优化的問题。

关键词：TNT；水环境；酶联免疫吸附分析法；半抗原；抗血清

中图分类号：TJ41；X832 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）01-0125-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.032

Feasible Analysis about Detection of TNT Concentration in Battlefield Water Environment by Enzyme-linked Immunosorbent Assay

LIU Jing-ting，QIAO Hua，FENG Xiao-jie，CHEN Zhi-li

（Dept. of National Defense Architecture Planning&Environmental Engineering，Logistic Engineering University of PLA，Chongqing 401311，China）

Abstract： To determine the availability of water sources by rapidly detecting the TNT concentration in battlefield water environment，the enzyme-linked immunosorbent assay of TNT was put forward. The key points of ELISA method were analyzed as below：three kinds of semi-antigen methods were proposed based on modification of TNT functional groups. Three artificial antigens were synthesized by employing different proteins coupling reactions corresponding to three kinds of semi-antigens. Artificial antigens of TNT stimulated animals to produce effective immune responses and produced antiserum to comply with requirements of ELISA. Sample pretreatment method was suitable for the rapid detection. Above research theoretically proved that the ELISA method was feasible and satisfactory for detecting TNT. Meanwhile，some problems urgently needed to be solved and optimized by the method were put forward.

Key words： trinitrotoluene； battlefield water environment； enzyme-linked immunosorbent assay； semi-antigen； antiserum

在现代化军事行动中，为作战部队保质保量提供生活用水是后勤保障系统职责所在。后勤工程学院于2002年自主研发的NJC2002-100/80净水车是能满足部队执行多样化军事任务时的应急供水保障装置。该净水车可利用战场环境中现有江河、湖泊水源就地取水，通过研发设计的水质净化程序使出水达到直饮水标准。但该净化程序只可对未受污染水源进行简易的消毒净化处理，而对于复杂战场环境尤其是对于极可能受到弹药污染水源则不能进行有效的检测判断。因此，快速有效地检测战地水源水质成为净水车取用水与否的先决条件。

目前被广泛用于各种军队装置及军事武器的爆炸性物质主要有梯恩梯（TNT）、地恩梯（DNT）、黑索金（RDX）、奥克托今（HMX）等[1]，其中硝基芳烃类化合物TNT居弹药用量首位，因此也是最为常见的战场水源污染物质[2]。TNT全称为2，4，6-三硝基甲苯，又名对称三硝基甲苯，是由甲苯经过三段硝化而制成的，其分子式为C7H5N3O6，相对分子质量227.13，结构式见图1。TNT属高度危害毒物，水体浓度大于2 ng/mL时即可引起亚急性中毒、慢性中毒，给身体造成不可逆的损害。目前常用于TNT检测的方法有质谱[3]、离子迁移光谱[4-6]、表面等离子共振[7]、分子印迹聚合物[8，9]，荧光偏振法[10]，但大都存在前处理繁琐，操作复杂，检测时间长且成本高的问题。因此快速高效的现场检测方法对战场水环境即时分析显得尤为重要。酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作为一种高效的生物分析技术，因其反应灵敏、特异性强、可进行现场测定等优点[11，12]，成为快速检测目标污染物的重要手段。本研究通过分析TNT的ELISA方法建立要点，讨论该方法应用于战场水源环境中TNT检测的可行性。

1 原理与方法

1.1 ELISA基本原理

ELISA作为常用的酶标记免疫分析方法，是一种依赖抗原抗体特异性与酶高效催化反应有机结合的综合性检测技术，原理是采用抗原与抗体的特异性反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色的深浅进行定量的测定[13]。因此利用目标物质TNT合成人工抗原后进行动物免疫产生特异性抗血清是方法建立的关键，而后根据ELISA检测步骤即可对经过前处理的水环境样品进行检测。

1.2 ELISA方法建立

1.2.1 半抗原合成 ELISA方法作為一种依赖抗原抗体特异性结合反应与酶高效催化反应有机结合的综合性检测技术，关键在于制备出针对目标物质的抗血清。由于TNT半抗原属于小分子物质，不能引起动物免疫反应，因此需要与载体蛋白质偶联以形成免疫原。另外TNT为对称三硝基稳定结构，不含与蛋白质直接反应的活泼官能团，因此需先将其官能团进行氨基化、羟基化或羧基化，具体反应可参考图2，图2中R代表TNT被取代硝基以外部分。

1.2.2 人工抗原合成 从上述TNT改造分子中选择两种或两种以上分别作为ELISA方法的免疫原分子与包被原分子。结合TNT官能团活化情况，分析采用活性酯法、戊二醛法、琥珀酸酐法等将其分别与不同的蛋白偶联合成人工免疫原和包被原，如图3所示，图3中R代表TNT被取代硝基以外部分。目前常用的载体蛋白有牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、兔血清白蛋白（Rabbit serum albumin，RSA）、锁孔血蓝蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）及卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。其中常用的KLH即血蓝蛋白，具有很高的免疫性，蛋白本身会刺激动物体形成免疫应答形成抗体，可能影响目标物质抗体纯度；BSA与KLH相比较属弱抗原化物的载体蛋白，它是最稳定的可溶白蛋白，便于后期检测偶联效果；OVA可作为包被原蛋白以与免疫原蛋白进行区别。赵晨等[10]在TNT的荧光偏振免疫检测方法研究中，将TNT羧基化后采用活性酯法与BSA成功进行偶联合成人工抗原TNT-BSA。

1.2.3 抗血清制备 免疫原合成后按照表1流程进行抗血清制备。选取新西兰大白兔作为免疫主体，首次免疫后2周进行加强免疫，而后每隔1周进行1次加强免疫。有研究表明，采用该方法对动物体进行关于2，2，4，4-四溴联苯醚的人工抗原刺激免疫[14]，免疫效果良好，所得抗血清效价达到ELISA方法抗血清效价要求。为保证获取高质量抗血清，可将免疫原分子与不同载体蛋白质偶联合成数种免疫原进行动物免疫，比较选取效价高、性质稳定的抗血清建立TNT的ELISA方法。赵晨等[10]制备的TNT-BSA抗血清达到工作浓度，证明动物体对TNT人工抗原具有免疫应答性。

1.2.4 样品前处理 由于ELISA方法所采用的抗血清是对目标化合物进行特异性识别，因此不需要富集分离等复杂的样品前处理步骤。采集的水样经玻璃纤维滤纸过滤后，加入1∶1体积有机溶剂超声后即可检测。有研究表明采用此方法进行多溴联苯醚加标环境样品的前处理，回收率为66.20%～88.57%[14]。若环境样品浓度过低，采用固相萃取小柱进行萃取富集即可检测[15]。

TNT作为目标物质具有可活化基团，具备合成多种半抗原的基础条件；TNT人工抗原可刺激动物形成免疫应答，获得抗血清效价可达到ELISA检测要求；样品前处理操作简单快捷，目标物质回收率达到微量或痕量物质检测要求，满足对战场水环境快速准确判断要求。

2 待解决问题

所制备TNT抗血清除对TNT进行特异性识别外，还可能与弹药中常见的二硝基甲苯、硝基苯甲酸、多硝基甲酚、多硝基苯、多硝基酚等硝基芳烃类物质结合，造成检测结果偏高或是假阳性结果。因此，还需对上述物质进行交叉反应率（CR）的检测，计算公式为：交叉反应率（CR）=（待测物IC50/类似物IC50）×100%。

ELISA方法根据酶催化产生的有色产物量形成的吸光度差异对待测物质进行定量分析，反应的时间、孵育温度等因素都会影响酶活性继而导致显色结果偏差[16]。因此，还需为适应战地复杂环境条件建立适应性强、稳定性高的检测条件。

ELISA试剂盒是基于ELISA原理设计生产的小型成套分析装置和试剂，可将TNT抗血清纯化获得TNT单克隆抗体用以研发便携试剂盒，提高现场检测能力。

3 小结

通过分析TNT的ELISA法建立原理与要点，分析得出利用该方法快速检测战地水源中TNT含量是可行的。但战地环境复杂，仍需通过大量模拟测试进行方法验证，另外还有若干问题亟待解决和改进，本研究仅为快速判断战场水源安全性提供一种新的检测方法以供参考。

参考文献：

[1] 田 涛，辛宝平，李玉平，等.火炸药废水处理技术综述[J].安全与环境报，2007，7（5）：60-64.

[2] 刘 鹏，张怀志，金昌根，等.废旧弹药爆破销毁技术综述[J].工程爆破，2011，17（1）：87-89.

[3] MA L，XIN B，CHEN Y. Direct mass spectrometric detection of trace explosives in soil samples[J].Analyst，2012，137（7）：1730.

[4] TABRIZCHI M， ILBEIGI V. Detection of explosives by positive corona discharge ion mobility spectrometry[J].Journal of Hazardous Materials，2010，176（1-3）：692-696.

[5] CAYGILL J S，DAVIS F，HIGSON P J.Current trends in explosive detection technique[J].Talanta，2012，88：14-29.

[6] ARMENTA S，ALCALA M. A review of recent，unconventional applications of ion mobility spectrometry（IMS）[J].Analytica Chimica Acta，2011，703（2）：114-123.

[7] RISKIN M，TEL-VERED R，LIOUBASHEVSKI O. Ultrasensitive surface plasmon resonance detection of trinitrotoluenen by a bis-aniline-cross linked Au nanoparticle composite[J]. Journal of the American Chemical Society，2009，131：7386-7378.

[8] WALKER N R，LINMAN M J，TIMMERS M M，et al. Selective detection of gas-phase TNT by integrated optical waveguide spectrometry using molecularly imprinted sol-gel sensing films[J].Analytica Chimica Acta，2007，593（1）：82-91.

[9] ALIZADEH T，ZARE M，GANJALI M R，et al.A new molecularly imprinted polymer（MIP）-based electrochemical sensor for monitoring 2，4，6-trinitrotoluene（TNT） in natural waters and soil samples[J].Biosensors & Bioelectronics，2010，25（5）：1166-1172.

[10] 趙 晨，侯 晨，陆文总，等.荧光分子印迹法检测炸药分子TNT[J].西安工业大学学报，2013，33（7）：549-553.

[11] XU TING， WANG JIA，LIU S Z，et al. A highly sensitive and selective immunoassay for the detection oftetrabromobisphenol A in soil and sediment[J].Analytica Chimica Acta，2012， 751（21）：119-127.

[12] M ？魣 GONZ？魣LEZCURBELO，LEHOTAY S J，HERN？魣NDEZBORGES J. Use of ammonium formate in QuEChERS for high-throughput analysisof pesticides in food by fast， low-pressure gas chromatography andliquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2014，1358：75-84.

[13] 张彦峰.典型污染物涕灭威、多环芳烃和三丁基锡的酶联免疫吸附分析研究[D].天津：南开大学，2006.

[14] 刘婧婷.多溴联苯醚的酶联免疫吸附分析的研究[D].天津：南开大学，2014.

[15] REZAEE M，MASHAYEKHI H A.Solid-phase extraction combined with dispersive liquid-liquid microextraction for the determination for polybrominated diphenyl ethers in different environmental matrices[J].Journal of Chromatography A，2012（9）：2887-2892.

[16] PALMIERI M，VAGNINI M，PITZURRA L，et al.Development of an analytical protocol for a fast，sensitiveand specific protein recognition in paintingsby enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）[J].Anal Bioanal Chem，2011，399（9）：3011-3023.