γ-干扰素释放试验对结核病患者临床诊断性能评价研究

秦建成，徐军，戴亮，赵静，王卫东，李想，张岚，毛远丽

γ-干扰素释放试验对结核病患者临床诊断性能评价研究

秦建成，徐军，戴亮，赵静，王卫东，李想，张岚，毛远丽

目的评价采用A.TB试剂［酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA）］进行结核杆菌特异性γ-干扰素释放试验（interferon-gamma release assays,IGRAs）对结核病的临床诊断性能及应用价值。方法108例研究对象中，临床明确诊断结核病60例（结核组），非结核病对照者48例（非结核对照组）。同时采用A.TB试剂（ELISA法）和T-SPOT. TB试剂［酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunosorbentspot,ELISPOT）］进行IGRAs。结果A.TB试剂（ELISA法）检测的灵敏度为86.67%，特异度为85.42%，受试者工作特征曲线（receiver-operating characteristic curve,ROC曲线）下面积为0.822，95%可信区间（confidence interval,CI）为0.733～0.912。T-SPOT.TB试剂（ELSPOT法）检测灵敏度为91.67%，特异度为87.50%，ROC曲线下面积为0.884，95%CI为0.806～0.962。ROC曲线下面积差异无统计学意义（χ2=0.081，P=0.776）。2种检测方法一致率为87.04%（94/108），Kappa值为0.738。结论A.TB试剂和T-SPOT.TB试剂检测的整体诊断性能相似，且A.TB试剂检测在操作和检测结果判读方面明显优于T-SPOT.TB试剂。

干扰素γ释放试验；结核分枝杆菌；预测；免疫印迹法；指示剂和试剂

结核病不仅是严重危害公众健康的全球性公共卫生问题，更是社会经济和居民健康水平等社会宏观因素的一种外在表现[1-2]。我国是全球第二大结核病高负担国家，结核病发病人数始终位居法定报告甲、乙类传染病前列[3]。因此结核病的防控十分重要，但传统的方法难以满足临床检测的需求。近年来结核分枝杆菌基因组学的研究成果——γ-干扰素释放试验（interferon-gamma release assays,IGRAs）在结核病诊断中的应用与研究越来越受到国内外专家学者的重视[4]。其中，T-SPOT. TB试剂［酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunosorbent spot,ELISPOT）］作为IGRAs的试剂于2001年获得美国食品药品监督管理局批准应用于临床，美国疾病预防控制中心推荐T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）检测为替代结核菌素试验更有效的方法，并为其制订了使用指南[5-6]。我国临床实验室及科研机构近几年也进行了基于IGRAs原理的结核检测产品研制与应用。本研究对基于同一IGRAs原理的国产A.TB试剂［酶联免疫吸附试验（enzyme-linked im-munosorbent assay,ELISA）］进行临床诊断性能评估，并与T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）对结核病患者的临床诊断性能进行比较。

1 对象与方法

1.1 对象共纳入108例研究对象。临床明确诊断结核病60例（结核组），其中菌阳肺结核21例，菌阴肺结核39例；男36例，女24例，年龄（43.1±5.4）岁。入选标准：菌阳肺结核为痰抗酸杆菌涂片连续2次（+），或1次（++），或1次结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）培养阳性；菌阴肺结核为痰抗酸杆菌涂片3次阴性以及Mtb培养1次阴性，有典型的肺结核临床症状和X线胸片表现，抗结核治疗有效，临床可排除其他非结核性肺部疾病。排除标准：急性病毒感染、妊娠和长期大量应用免疫抑制剂者。非结核病对照者48例（非结核对照组），其中男27例，女21例，年龄（42.6±12.4）岁。非结核对照组均经病理或临床检查确诊，既往无结核病史和接触史，结核菌素试验均为阴性，为Mtb感染低暴露风险的慢性乙型肝炎患者。本研究经医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂A.TB试剂盒系海口维瑅瑷生物研究院产品；T-SPOT.TB试剂盒系英国Oxford Immunotec公司产品；AIM-V培养液和PRMI 1640培养液系美国Gibcobrl公司产品；淋巴细胞分离液系CEDARLANE公司产品。

1.2.2 仪器仪器包括美国伯乐Bio-rad酶标仪、Sanyo CO2培养箱（CO2Incubator）、Thermo MSC-1.2 1PE AC超净工作台、contess细胞计数仪和C.T.L. S6UV酶联斑点计数仪。

1.3 检测方法

1.3.1 A.TB试剂（ELISA法）检测采集3ml外周血标本置于肝素锂抗凝试管中，立即混匀，16 h内将新鲜全血分别加入到含有阴性刺激剂（N）、阳性刺激剂（P）和特异性抗原刺激剂（T）的3支试管中，每管1ml，混匀，37℃孵育22～24 h后收集血浆，ELISA法检测血浆中干扰素γ的含量，孵育后血浆可于2～8℃保存，2周内检测，或-20℃以下长期保存。结果判读：参照A.TB试剂盒说明书，当N＜500 IU/L时，（T-N）/（P-N）≥0.6；或N≥500 IU/L时，（T-N）/（P-N）≥0.85，均判定为阳性，否则为阴性。

1.3.2 T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）检测采集6 ml外周血，4 h内进行单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）分离；将细胞多次洗涤后计数，并将标本浓度调整至250万/m l。按TSPOT.TB试剂盒说明书将细胞悬液加入专用微孔板。37℃5%CO2孵育箱中孵育16～20 h，磷酸盐缓冲液洗板，加抗体，于2～8℃冰箱孵育1 h，洗板，显色7min，蒸馏水冲洗后观察结果。用酶联斑点计数仪观察并计数每个孔中的斑点。结果判读：阴性斑点数为0～5个，抗原A和抗原B检测孔计数-阴性孔计数≥6判定为阳性；如果阴性对照孔斑点数≥6，检测孔斑点数≥2倍阴性孔斑点数判定为阳性。

1.4 统计学处理应用SPSS 16.0软件进行统计分析。计算2种方法的灵敏度和特异度。A.TB与T-SPOT.TB试剂检测诊断效能采用一致性检验。分别绘制2种试剂检测的受试者工作特征曲线（receiver-operating characteristic curve,ROC曲线），比较曲线下面积。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 诊断试验结果A.TB试剂（ELISA法）检测灵敏度为86.67%，特异度为85.42%；T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）检测灵敏度为91.67%，特异度为87.50%。见表1～2。

表1 A.TB试剂(ELISA法)诊断试验结果(例)Table 1 Diagnostic results of ELISA-based IGRAs w ith A.TB kit(cases)

表2 T-SPOT.TB试剂(ELISPOT法)诊断试验结果(例)Table 2 Diagnostic results of ELISPOT-based IGRAs w ith T-SPOT.TB kit(cases)

2.2 一致性检验结果比较A.TB试剂（ELISA法）和T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）检测的诊断结果，检测均为阳性的53例，均为阴性的41例，一致率为87.04%（94/108），Kappa=0.738，提示2种试剂检测具有较高的一致性。见表3。

表3 A.TB试剂(ELISA法)和T-SPOT.TB试剂(ELISPOT法)检测的一致性检验(例)Table 3 Consistency between ELISA-based IGRAs w ith A.TB kit and ELISPOT-based IGRAs w ith T-SPOT.TB kit(cases)

2.3 ROC曲线分析以病原学检测为金标准，做A.TB试剂（ELISA法）和T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）诊断108例患者的ROC曲线。用双正态参数法计算曲线下面积。A.TB试剂（ELISA法）检测的ROC曲线下面积为0.822，95%可信区间（confidence interval,CI）为0.733～0.912；T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）检测的ROC曲线下面积为0.884，95%CI为0.806～0.962（图1）。2个ROC曲线下面积差异无统计学意义（χ2=0.081，P=0.776）。取曲线斜率45度切点位置为诊断阈值，A.TB试剂（ELISA法）的诊断阈值为0.6（比值），对应的灵敏度为86.67%，特异度为85.42%；T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）得诊断阀为6（斑点数），对应的灵敏度为91.67%，特异度为87.50%。

图1 A.TB试剂(ELISA法)和T-SPOT.TB试剂(ELISPOT法)诊断结核病的ROC曲线Figure 1 ROC curves of ELISA-based IGRAsw ith A.TB kit and ELISPOT-based IGRAsw ith T-SPOT.TB kit

3 讨论

IGRAs是近年来发展起来的用于检测Mtb感染的新方法，国外资料报道其检测潜伏性Mtb感染的灵敏度达70%～80%，特异度达88%～97%[6]。我国Mtb感染率高，流行病学背景不同于欧美国家，IGRAs主要应用于结核病的诊断和鉴别。Mtb感染与结核病也有着较大差别，IGRAs并不能明确区分活动性结核病和潜伏性Mtb感染。本研究旨在探讨A.TB试剂（ELISA法）对结核病患者的临床诊断性能及应用价值。

根据IGRAs原理发展来的检测方法有基于全血培养的ELISA法，如QuantiFERON-TB、Gold In-Tube、QFT-GIT等检测方法和基于PBMCs培养的ELISPOT法，如T-SPOT.TB检测方法。目前已有大量国内外研究表明，IGRAs的2种方法（ELISA法和ELISPOT法）的诊断性能相似[7-9]，这与本研究结果相符。

虽然A.TB试剂（ELISA法）检测与T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）检测都是基于IGRAs原理的结核检测方法，但它们在检测技术、试验操作以及在临床检验科室使用的便捷性等方面有着显著区别。A.TB试剂（ELISA法）检测是通过ELISA法检测全血中的干扰素γ水平，而T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）是通过ELISPOT法检测PBMCs中释放干扰素γ的效应T细胞数量。在样本采集和处理过程中，A.TB试剂（ELISA法）检测要求采集3ml肝素抗凝静脉全血，室温保存，可16 h内使用，从样品处理到检测只需要全血分装和37℃培养2步，操作简单，不需要专业培训。检测过程使用ELISA法，通过制作标准曲线来计算患者特异性T细胞因特异性抗原刺激后干扰素γ分泌的水平。通过标准曲线计算出N、P和T 3个培养管中干扰素γ的含量，以此来判断结果。因为全血培养检测模拟人体内自然的免疫反应过程，不改变T细胞的数目和存在环境，结果更真实。T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）检测要求采集6ml肝素抗凝静脉全血，室温保存，仅4 h内使用。处理过程需要PBMCs分离、多次洗涤、T细胞稀释计数、二氧化碳培养等步骤。操作要求高，需要专门细胞间进行细胞操作。对操作人员的操作要求高，需要进行专门的培训。该检测以计算阳性细胞数目来判断检测结果，细胞计数可使用显微镜和放大镜进行人工计数，工作量大，受主观因素影响多；使用酶联斑点图像分析仪，其计数准确，但价格昂贵。T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）检测在试验操作、试验条件、人员技术以及仪器设备等方面均要求较高，在临床检验科室使用的便捷性等方面受到限制，不太适合社区等的小型医院使用。实际操作中T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）检测结果判读常见斑点模糊不易计数，阴、阳性对照孔斑点容易污染，甚至出现不确定结果等现象。而A.TB试剂（ELISA法）检测结果判读为综合考虑全血细胞的本底对照、特异性细胞免疫反应、非特异性细胞免疫反应等因素的影响，避免了不确定结果的出现。

虽然A.TB试剂（ELISA法）检测和T-SPOT.TB试剂（ELISPOT法）检测是目前检测结核病的较为准确、先进的2种方法，但它们在试验技术与临床应用等方面还存在一些问题，如试验结果的影响因素不是十分明确,试验条件有待进一步优化,在结核病伴严重免疫系统疾病中的研究不足等。相信通过不断的探索、研究与改进，定会使A.TB试剂（ELISA法）检测在结核病检测中发挥其更大的作用。

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（2014-08-12收稿2014-09-11修回）

（责任编委王永怡本文编辑王姝）

Evaluation of clinical diagnostic performance of interferon-gamma release assays for tuberculosis

QIN Jian-cheng,XU Jun,DAILiang,ZHAO Jing,WANGWei-dong,LIXiang,ZHANG Lan,MAO Yuan-li*
Clinical Laboratory Center,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China
*Corresponding author,E-mail:maoyuanlee@163.com

Objective To evaluate the diagnostic performance and application value of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based interferon-gamma release assays(IGRAs)with A.TB kit for patientswith tuberculosis.M ethods Of 108 patients enrolled in the study,60 were definitely diagnosed with tuberculosis(tuberculosis group),and 48 were controls(non-tuberculosis group). ELISA-based IGRAs with A.TB kit and enzyme-linked immunosorbent spot(ELISPOT)-based IGRAswith T-SPOT.TB kitwere carried out simultaneously.Results The sensitivity and specificity of ELISA-based IGRAs with A.TB kit were 86.67%and 85.42%, and the area under a receiver-operating characteristic(ROC)curve was 0.822[95%confidence interval(CI),0.733-0.912].The sensitivity and specificity of ELISPOT-based IGRAs with T-SPOT.TB kitwere 91.67%and 87.50%,and the area under ROC curve was0.884(95%CI,0.806-0.962).The difference in the area under ROC curvewas notsignificantbetween the two assays(χ2=0.081,P= 0.776).The consistency of the two assays was 87.04%(94/108)with the Kappa value of 0.738.Conclusions ELISA-based IGRAs with A.TB kit and ELISPOT-based IGRAs with T-SPOT.TB kit have a similar overall diagnostic performance,but ELISA-based IGRAswith A.TB kit is superior to ELISPOT-based IGRAswith T-SPOT.TB kit in the operation and interpretation of the test results.

interferon-gamma release tests;Mycobacterium tuberculosis;forecasting;immunoblotting;indicators and reagents

R392.114；R378.911

A

1007-8134(2014)05-0302-04

国家“十二五”科技重大专项（2013ZX09J13106-06A）

100039北京，解放军第三○二医院临床检验医学中心（秦建成、徐军、戴亮、赵静、王卫东、李想、张岚、毛远丽）

毛远丽，E-mail:maoyuanlee@163.com