埃博拉病毒感染性标本在生物安全三级实验室的临床检验与生物安全防护

郑江花，胡绿荫，李海聪，王刚，毛会军，曹宇硕，卢洪洲

·特别报道·

埃博拉病毒感染性标本在生物安全三级实验室的临床检验与生物安全防护

郑江花，胡绿荫，李海聪，王刚，毛会军，曹宇硕，卢洪洲

本文参考美国疾病预防控制中心的最新资讯和中国疾病预防控制中心制定的《埃博拉出血热个人防护指南（第二版）》，介绍当前在生物安全三级实验室开展埃博拉病毒感染者血液标本临床检验策略的最新研究进展，主要包括临床检验的操作流程以及操作人员必要的生物安全防护要点。

埃博拉病毒属；临床试验；检疫

埃博拉病毒是病毒性出血热的病原体之一，在人类和非人类的灵长类动物（如猴子、大猩猩和黑猩猩）中引起的疾病往往非常严重，甚至致命。自1976年在刚果共和国埃博拉河附近首次发现埃博拉病毒感染病例后，2014年的大暴发是埃博拉病毒在西非发生的迄今为止最大的一次感染事件，截至2014年10月20日已有9191例感染埃博拉病毒，其中4546例死亡[1]。埃博拉病毒传染性极强，可通过直接接触患者的血液或分泌物（尿液、粪便、精液和乳汁等）或是被污染的物体表面感染[2]。埃博拉病毒归属于丝状病毒科埃博拉病毒属，有5个亚型，其中4个亚型可引起人类疾病，分别是扎伊尔亚型、苏丹亚型、科特迪瓦亚型和本迪布焦亚型。《人间传染的病原微生物名录》[3]将埃博拉病毒归属于第一类、四级生物危害等级的病原微生物，处理未经培养的感染性材料必须在生物安全三级（biosafety level-3 laboratory,BSL-3）实验室内进行。2014年8月26日我国国家卫生和计划生育委员会专家批准上海市公共卫生临床中心BSL-3实验室的埃博拉病毒扩项申报，专家对于如何在BSL-3实验室内开展埃博拉病毒感染者血液标本的血细胞分析和临床生物化学检验给予了一系列指导意见。本文参考美国疾病预防控制中心的最新资讯和中国疾病预防控制中心制定的《埃博拉出血热防控方案（第二版）》[2，4]，介绍上海市公共卫生临床中心在BSL-3实验室开展埃博拉病毒病感染者的血液标本临床检测策略的最新研究进展。

1 开展埃博拉应急检测的硬件设施

《人间传染的病原微生物名录》[3]将埃博拉病毒归属于第一类、四级生物危害等级的病原微生物，属于高致病性病原微生物，未经培养的感染性材料必须在BSL-3实验室内进行。感染者血液在BSL-3实验室内进行临床检测（如血细胞分析和临床生物化学检测）时需要相应的仪器设备，如全自动血细胞分析仪和生化分析仪。可将全自动血细胞分析仪和生化分析仪放置于BSL-3实验室的生物安全柜内，仪器的大小须考虑符合安全柜内空间，仪器应具备较高的自动化程度，可以自动吸样以尽量避免工作人员进行打开标本盖的操作，减少气溶胶的产生。我们选择SYSMEX XS-1000i全自动血细胞分析仪（SYSMEX株式会社，日本）和FUJIDRI-CHEM4000全自动干式生化分析仪（富士公司，日本）以满足生物安全防护的需要。

2 BSL-3实验室内个人防护

在BSL-3实验室内的所有操作必须符合《埃博拉出血热个人防护指南（第二版）》[4]的三级个人防护要求，做好个人防护用品的穿戴：穿一次性防护服、隔离衣、防渗漏胶鞋、短鞋套及防渗漏长鞋套，戴医用N95口罩和工作帽、正压防护面罩及双层防渗漏乳胶手套。严格按照BSL-3生物安全防护用品的穿戴和脱卸流程操作，脱卸一次性防护用品时须注意每脱卸1件防护用品前都先用75%酒精喷洒防护用品的外表面进行消毒。

3 临床检测流程

由中心应急办统一指挥和协调，通知检验科负责人准备开始承担感染者的临床检验工作。

3.1 准备检验科负责人接到通知后，立即召开科室紧急启动会议，传达上级指示，布置当前任务。联系BSL-3实验室负责人，做好仪器和试剂等准备工作。根据检验科应急工作人员安排表组织落实检测人员，检测人员按照《埃博拉出血热个人防护指南（第二版）》[4]的三级个人防护要求做好个人防护，准备接收患者样本进行检测。

3.2 标本运送病房将开展相应检验项目的标本经专人专车送往应急实验室（BSL-3），标本运送人员应按照《埃博拉出血热应急工作手册》[5]中的二级个人防护流程做好防护用品的穿戴：戴医用N95口罩和防护眼罩，穿工作服、隔离衣、二层鞋套及防渗漏长靴，戴双层乳胶手套和工作帽。收集标本时必须仔细检查采样容器是否完好无损并盖紧，采样容器上是否写明患者姓名、病区/床号、标本的种类及采样时间（护士填写），确认样本合格并在标本接收登记本上做好登记后，对标本外表面喷洒75%酒精消毒，放入印有生物危害标识的“应急检测标本专用运送箱”（运输包装分类：UN2814类型A类感染性材料）（图1），用合适的容器固定，以免颠簸导致泄漏或破碎，再对转运箱的外表面喷洒75%酒精消毒。气温超过25℃须在“应急检测标本专用运送箱”内放置医用冰袋，冰袋上放固定容器。标本运送人员在离开病区时，以75%酒精喷洒手套、外层隔离服和鞋套。标本运送人员将“应急检测标本专用运送箱”置于避光、防雨、防震的标本运送车上，须非常仔细、小心地送至应急实验室1楼的标本传递窗内，以紫外线照射表面15min。

图1 传染性标本包装与运输说明示意图[6]Figure 1 Packaging and transporting diagram of infectious specimen[6]

一名生物安全部实验室人员将“应急检测标本专用运送箱”转运至BSL-3实验室准备间的传递窗内，此时一名临床检测实验室工作人员与另一名生物安全部工作人员做好三级个人防护，进入BSL-3实验室准备间。打开传递窗内的“应急检测标本专用运送箱”，以75%酒精喷洒后取出箱内的内层样本管包装桶并将其转移至核心区的传递窗中，打开紫外线照射5min。工作人员来到BSL-3实验室核心区，在生物安全柜内打开内层样本管包装桶盖，取出标本管，即1支2ml EDTA抗凝全血管和1支3.5ml血清管，分别用于患者的血细胞分析和临床生物化学项目检测。临床生物化学检测项目包括电解质、肝功能和肾功能等基本临床指标。

3.3 标本检测临床实验室工作人员在生物安全部工作人员的配合下，按照SYSMEX XS-1000i全自动血细胞分析仪和FUJIDRI-CHEM4000全自动干式生化分析仪的操作流程，在生物安全柜内完成标本检测。实验操作的动作要轻柔，在工作台面预先铺上铺巾。操作过程中禁止工作人员的手部随意进出生物安全柜。血细胞分析的标本无须打开标本盖，只须将标本放置在SYSMEX XS-1000i全自动血细胞分析仪的进样架上自动检测，检测结果会通过联机系统传送到安全柜外的LIS信息系统电脑上，临床实验室工作人员审核并发布报告。生物化学检测的标本须离心后才能上机检测，离心过程容易产生气溶胶，所以离心和标本开盖上机的一系列操作中须注意很多细节：先将带盖离心桶（转头）放置于安全柜内，将标本喷洒75%酒精消毒后包裹上吸水纸轻轻放入50ml塑料离心管中，再把离心管放入离心桶中，盖好盖子，消毒离心桶外表面后移出安全柜，高速冷冻水平离心机3000 rpm/min离心10min。离心机停止转动后，静止10min，然后将离心桶放入生物安全柜内，分别打开桶盖和50ml离心管盖。打开50ml离心管盖后，观察有无样本溢出，右手用饱含75%酒精的吸水纸握住标本管盖，左手用饱含75%酒精的吸水纸握住样本管的下部分，轻轻旋转打开标本盖，将标本放入FUJIDRI-CHEM4000全自动干式生化分析仪的标本位，开始检测[7]。检测结果通过联机系统传送到安全柜外的LIS信息系统电脑上，临床实验室工作人员审核并发布报告。

3.4 清场与消毒操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用75%酒精擦拭外表面后移出生物安全柜放入指定地点。血细胞分析仪和生化分析仪外表面用75%酒精喷洒，作用时间10min以上。用75%酒精擦拭工作台面、生物安全柜内壁及台面，并继续运行生物安全柜30min后关闭。确定实验区内无本次操作遗留的物品，检查实验室内压力是否正常。实验人员按照进出BSL-3实验室的操作规程退出实验室。

3.5 废弃物处理所有剩余或废弃标本等污染物装入高压灭菌袋中，用高压指示带松松扎口，并用75%乙醇消毒剂喷洒袋外侧后移出生物安全柜。经高压蒸汽灭菌后，作为医疗废弃物焚烧。未经许可实验室一律不保存埃博拉病毒血液样本。

4 安全危险及其防护措施

在处理样品的操作步骤中，有可能产生的生物危险是当打开标本容器盖时，样品管轻微振荡后有可能产生气溶胶；样本量过多时，有可能发生样本溢出；离心后有可能产生气溶胶和离心管破裂。埃博拉病毒作为高致病性病原微生物，目前已经被美国疾病预防控制中心列为管制病原[8]，所有未灭活标本的临床检测须严格遵循BSL-3操作水平的要求，应在生物安全柜内处理标本，穿隔离衣，戴双层乳胶手套、帽子、N95口罩和正压防护面罩进入BSL-3实验室。工作人员在BSL-3实验室内操作样本时，在做好个人防护的同时，还须知晓一些个人生物安全防护的处理细节。

4.1 防止气溶胶产生和吸入的个人防护措施应事先在生物安全柜台面铺上铺巾；带盖的样品管轻微振荡后应静止10min；离心机停止转动后，静止10min，然后将转头放入生物安全柜分别打开转头盖和离心管盖；标本盖在生物安全柜中轻轻地打开；实验人员实验时佩戴N95口罩和正压防护面罩。

4.2 防止标本溢出的个人防护措施应事先在生物安全柜台面铺上铺巾；实验人员轻轻打开盖，若发生样品溢出，喷洒75%酒精消毒标本外表面，随后立即用饱含75%酒精的吸水纸擦拭污染区域，作用适当时间（15min以上），擦拭结束后操作人员立即更换外层手套。

4.3 离心管破裂时的操作步骤如果仪器正在运行，应立即关闭仪器电源，仪器保持密闭30min以使气溶胶沉积；如果仪器已经停止，应保持盖子密闭30min；所有的操作都应戴厚橡胶手套，清理玻璃碎片时应当使用镊子；所有破损的离心管、玻璃碎片、离心桶、十字轴和转子都应放在75%酒精内浸泡24 h，再高压灭菌消毒。未破损的带盖离心管应放入另一个装有消毒剂的容器中，然后回收；离心机内腔应用75%酒精擦拭，并重复擦拭1次，然后用水冲洗并干燥。清理时使用的所有材料都应按感染性废弃物处理。

综上所述，在BSL-3实验室内开展埃博拉感染性标本的血细胞分析和临床生物化学检验可以在第一时间为临床医生提供患者必要的信息，有助于患者的对症治疗。作为临床实验室工作人员在检测该高致病性病原微生物的临床样本时，必须严格遵循BSL-3操作水平要求，做好严格的个人防护，所有的样本操作必须在生物安全柜内进行。工作人员应熟悉操作流程，在所有临床检验操作过程中，动作应该轻柔，避免发生生物安全事件，自始至终保证工作人员的人身安全为第一要务。

[1]WHO.埃博拉致西非三国4546人死亡［EB/OL］.［2014-10-19］. http://news.sina.com.cn/o/2014-10-19/052031010635.shtml.

[2]CDC.2014 Ebola outbreak in West Africa［EB/OL］.［2014-09-12］. http://www.cdc.gov/vhf/ebola/outbreaks/guinea/index.htm l.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.人间传染的病原微生物名录［EB/OL］.［2014-09-10］.http://www.moh.gov.cn/mohbgt/pw10602/200804/20471.shtml.

[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.埃博拉出血热防控方案（第二版）［J］.传染病信息，2014，27(4):Ⅰ-Ⅱ.

[5]上海市公共卫生临床中心应急办公室.埃博拉出血热应急工作手册［EB/OL］.［2014-09-01］.http://www.shaphc.org/webContent/ new_znss.aspx?coid=0&name=%e5%9f%83%e5%8d%9a%e6% 8b%89.

[6]CDC.Interim guidance for specimen collection,transport,testing, and submission for persons under investigation for Ebola virus disease in the United States［EB/OL］.［2014-09-12］.http://www.cdc. gov/vhf/ebola/hcp/interim-guidance-specimen-collection-submission-patients-suspected-infection-ebola.htm l.

[7]中华人民共和国卫生部医政司.《全国临床检验操作规程》第三版［EB/OL］.［2014-09-12］.http://xidong.net/File001/File_61458. htm l.

[8]CDC.Interim guidance regarding compliancewith selectagent regulations for laboratories handling patient specimens that are known or suspected to contain Ebola virus［EB/OL］.［2014-09-12］.http: //www.cdc.gov/vhf/ebola/hcp/select-agent-regulations.html.

（2014-09-15收稿 2014-10-20修回）

（责任编委 李 军 本文编辑 陈玉琪）

Clinical exam ination and personal biosafety protection for infectious specimensw ith Ebola virus in biosafety level 3 laboratory

ZHENG Jiang-hua,HU Lü-yin,LIHai-cong,WANG Gang,MAO Hui-jun,CAO Yu-shuo,LU Hong-zhou*
Shanghai Public Health Clinical Center,Fudan University,Shanghai201508,China
Correspondong author,E-mail:luhongzhou@shaphc.org

In compliance with the latest informations released by American Centers for Disease Control and Prevention(CDC) and the“Ebola hemorrhagic fever personal protection guide(second edition),”issued by China Center for Disease Control and Prevention,we present and describe here the latest research progresses about performing clinical examinations strategies for infectious blood samples with Ebola virus from patients in biosafety level 3 laboratory at present.The presenting main contents at present include standard operating procedures for clinical examinations and key points about personal biosafety protection when laboratory technicians operate in biosafety level 3 laboratory.

Ebola virus；biosafety level 3 laboratory;clinical examination;biosafty protection

R373.32

A

1007-8134(2014)05-0257-03

国家863项目（SS2014AA021403）；上海市公共卫生临床中心科研启动基金（201301、201309）

201508，上海市（复旦大学附属）公共卫生临床中心（郑江花、胡绿荫、李海聪、王刚、毛会军、曹宇硕、卢洪洲）；200040上海，复旦大学附属华山医院感染病科（卢洪洲）

卢洪洲，E-mail:luhongzhou@shaphc.org