Br uke r B iotype r和Vitek MS系统质谱分析鉴定革兰阴性菌临床分离株的比较研究

王璐，杨柳，任微，褚美玲，孟冬娅，薛文成

Br uke r B iotype r和Vitek MS系统质谱分析鉴定革兰阴性菌临床分离株的比较研究

王璐，杨柳，任微，褚美玲，孟冬娅，薛文成

目的比较并评价两种基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）系统——Bruker MALDIBiotyper系统（以下简称Bruker Biotyper系统）和MALDITOFVitek MS系统（以下简称Vitek MS系统）在革兰阴性菌临床分离株鉴定中的应用。方法收集沈阳军区总医院2012年3月—2013年1月分离自血液、尿液、脑脊液、分泌物、伤口拭子和痰液临床标本的革兰阴性菌共120株。应用Vitek 2Compact生化鉴定系统将每株细菌鉴定到种，而后采用Bruker Biotyper和Vitek MS系统对其进行鉴定，三者鉴定结果存在差异的菌株经16S rDNA测序最终确认菌种。结果对于120株革兰阴性菌临床分离株，Bruker Biotyper和Vitek MS系统在属的水平上正确鉴定率分别为95.0%和92.5%，在种的水平上正确鉴定率分别为89.2%和86.7%，差异均无统计学意义。结论Bruker Biotyper和Vitek MS系统对革兰阴性菌临床分离株的正确鉴定率不存在差异，两种系统的鉴定结果与各自的图谱数据库有密切关系。

光谱法，质量，基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；图谱；革兰阴性菌

目前，中国大多数临床实验室的细菌鉴定主要依靠常规生化反应鉴定和表型鉴定，包括传统手工法和自动化仪器鉴定系统。传统的鉴定方法既繁琐又费时，从细菌分离培养到鉴定结果报告，至少需要48～72 h，自动化仪器鉴定提高了检测效率，但通常也需要18～24 h发出报告。与其相比，分子学鉴定方法（如荧光杂交和PCR法）快速、准确，但成本昂贵而且耗力，并不适合于常规大量样本的鉴定。临床医师急需病原微生物的鉴定结果以明确感染源并进行下一步治疗，因此，微生物实验室开展一种简单快速、准确高效的微生物鉴定方法已成为大家关注的焦点。

本研究分别应用德国Bruker Daltonics公司和法国bioMérieux公司的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laserdesorption ionization time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS）对分离自临床标本的120株革兰阴性菌进行鉴定，对检测结果存在差异的菌株经16S rDNA测序进行确认，并对两种质谱鉴定系统的检测结果进行比较和评估。

1 材料与方法

1.1 菌株来源收集沈阳军区总医院2012年3月—2013年4月革兰阴性菌临床分离株120株（代表40个菌属和81个菌种）。菌株来源：血液40株、痰液38株、尿液23株、分泌物10株、脓汁2株、脑脊液4株、粪便2株和伤口拭子1株。

1.2 主要仪器及试剂主要仪器及试剂包括BrukerMALDIBiotyper系统（Bruker Daltonics公司，德国）（以下简称Bruker Biotyper系统）、MALDI-TOFVitek MS系统（bioMérieux公司，法国）（以下简称Vitek MS系统）、Vitek 2 Compact自动鉴定仪（bioMérieux公司，法国）、GN、NH和ANC细菌鉴定卡（bioMérieux公司，法国）、基因组DNA小量提取试剂盒及PCR反应相关试剂（大连宝生物公司）以及Roche480Ⅱ实时荧光定量PCR仪（Roche公司，瑞士）。

1.3 细菌分离培养所有菌株标本均接种在合适的培养基上（5%羊血琼脂或巧克力培养基），于35℃孵育箱恒温培养18～24 h（生长条件有特殊要求的菌株置于5%～10%CO2培养箱或厌氧袋中）。每天观察平板生长状况及菌落形态，18～24 h后对菌落进行次代纯培养。

1.4 Vitek 2Compact生化鉴定对纯培养菌株进行革兰染色，严格按照Vitek 2 Compact系统操作程序及GN、NH和ANC细菌鉴定卡说明书进行操作。首先挑取纯培养菌落，用0.45%无菌氯化钠溶液配置成相应浊度的菌悬液，然后应用相应卡片上机鉴定。

1.5 MALDI-TOF-MS系统鉴定

1.5.1 点样用无菌接种环挑取适量（3～5个）纯培养单个菌落涂在质谱仪样品检测板上，迅速点样0.5μl的甲酸覆盖加样的位置，随后再点样1μlα-氰基-4-羟基肉桂酸溶液覆盖。室温放置，待基质液干燥后，将检测板放入质谱仪检测。将质控菌株大肠埃希菌ATCC8739作为每一组的校准靶点。

1.5.2 Bruker Biotyper系统结果判读先通过MALDI-TOF-MS采集多肽和蛋白质的谱峰，再按质量大小排序形成特征的峰谱，即指纹图，通过每种细菌独特的蛋白组成来鉴定细菌，应用于不同菌株的鉴定与区分。以线性正性模式用最大频率（20～200Hz）采集相对分子质量2～20 kDa的图谱，用Biotyper软件对所采集的谱图进行分析。当Bruker Biotyper系统分值≥1.7时，认为结果高度可信。

1.5.3 Vitek MS系统结果判读先通过MALDITOF-MS获得谱图，然后与Vitek MS数据库中不同微生物家族的种/属特定谱图相比对，从而得出鉴定结果。数据库包含大量临床相关细菌菌种，运用专用计算方法增加细菌鉴定的准确率。系统以线性正性模式用50 Hz频率采集相对分子质量2～20 kDa的图谱，并采用先进的ASC运算法对所得谱图进行分析。根据所得谱图与数据库参考谱图匹配程度，BioTyper软件匹配模式可得到0～100的分值（对数值1～3），Vitek MS系统可得到0%～99.9%的数值，当Vitek MS系统分值≥70%时，认为结果高度可信。

1.6 16S rDNA检测及测序细菌DNA提取采用大连宝生物有限公司DNA提取试剂盒（MiniBEST BacterialGenomic DNA Extraction KitⅡ），严格按照说明书要求进行提取。16S rDNA基因扩增严格按照试剂盒（TakaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit）说明书进行。PCR基因测序由大连宝生物有限公司测序部完成；测序后序列在GenBank数据库中进行在线比对。

1.7 鉴定结果判读当Bruker Biotyper、Vitek MS和Vitek 2Compact系统三者鉴定结果一致时，将此鉴定结果作为最终确认菌种结果；当三者鉴定结果有任何不一致，以16S rDNA基因测序结果为确认结果。根据参考菌株和系统分值，将质谱鉴定结果分类如下：①正确鉴定到种，即质谱鉴定结果与参考菌株在种的水平上完全一致；②正确鉴定到属，即质谱鉴定结果与参考菌株在属的水平上一致；③错误鉴定，即质谱鉴定结果与最终确认菌株在属的水平上不一致；④无法鉴定，当Bruker Biotyper系统鉴定分值＜1.7，VitekMS系统鉴定分值＜70%。

1.8 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计分析，2组间计数资料比较用四格表χ2检验或连续性校正χ2检验或Fisher精确概率检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 120株革兰阴性菌临床分离株鉴定结果对于本研究中的120株革兰阴性菌临床分离株，Bruker Biotyper和Vitek MS系统在属的水平上正确鉴定率分别为95.0%（114株）和92.5%（111株），差异无统计学意义（χ2=0.640，P=0.424）；二者在种的水平上正确鉴定率分别为89.2%（107株）和86.7%（104株），差异无统计学意义（χ2=0.353，P=0.552）。见表1。

2.2 Bruker Biotyper或Vitek MS系统错误鉴定或未鉴定出结果的菌株Bruker Biotyper和Vitek MS系统的鉴定结果与16S rDNA测序结果不符合率分别为5.0%（6株）和7.5%（9株）。Bruker Biotyper系统未鉴定出结果的菌株共有5株，包括铜绿假单胞菌1株，脑膜败血性黄杆菌1株，普城沙雷菌1株，皮氏罗尔斯顿菌1株和衣氏放线菌1株，此外，Bruker Biotyper系统将1株水生拉恩菌鉴定错误。Vitek MS系统未鉴定出结果的菌株共有8株，包括聚团肠杆菌1株，雷极普罗威登菌1株，栖稻假单胞菌2株，放射根瘤菌1株，创伤弧菌1株，芳香类香味菌1株和衣氏放线菌1株，此外，Vitek MS系统将1株宋内志贺菌鉴定错误。对于研究中的1株衣氏放线菌二者均未鉴定出结果，归因于这个菌种并不存在于二者的数据库中。

表1 Bruker Biotyper和Vitek MS系统的鉴定结果(株)Table 1 Results of identification by Bruker Biotyper system and Vitek MS system(isolates)

3 讨论

近年来，MALDI-TOF-MS作为一种新兴的微生物鉴定技术，得到众多研究的认可[1-14]。与传统生化表型鉴定和分子生物学鉴定方法相比，以MALDITOF-MS为基础的鉴定系统是一种准确快速、经济有效的微生物鉴定系统[5，9-11]。将MALDI-TOF-MS与实验室信息系统和其他自动化设备连接起来，以此而形成的多种鉴定方法正在应用或发展中[12]。现今，一些操作简易的商业化质谱仪已经在常规微生物鉴定中得到应用，例如德国Bruker Daltonics公司的Burker Biotyper系统、法国bioMérieux公司的Vitek MSRUO和Vitek MS系统以及法国SAS公司的Andromas检测系统。这些系统拥有不同的图谱数据库和独特的数据分析计算法则[15]，因其鉴定的独特优势已广泛应用于临床细菌鉴定的工作中。

早期研究认为质谱仪对非发酵菌[16]、沙门菌[17]等很多细菌的鉴定准确率近乎100%。而本研究中对某些非发酵菌的鉴定中存在未被鉴定出结果的现象，如Bruker Biotyper系统在1株铜绿假单胞菌和1株脑膜败血性黄杆菌的鉴定中未鉴定出结果，而Vitek MS系统在2株栖稻假单胞菌和1株芳香类香味菌的鉴定中未鉴定出结果，原因可能在于质谱仪数据库中无这些菌株。国内有研究报道，利用MALDI-TOF-MS对包括肠杆菌科细菌、嗜血杆菌及非发酵菌在内的9种180株革兰阴性菌进行鉴定，符合率达到96.7%[18]，略高于本次研究，可能因其涵盖的阴性菌种类明显少于本次研究。

本研究中的120株革兰阴性菌临床分离株包括40个菌属和81个菌种，囊括了临床工作中绝大多数的革兰阴性杆菌，对大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、不动杆菌属细菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌，两种质谱仪都能进行准确鉴定。对于衣氏放线菌，由于二者数据库中不存在此菌种，因此都未能鉴定出来。有些菌株在首次检测中无法被鉴定，但经2～3次重复检测后，部分菌株能得到准确鉴定，这表明操作者和样品准备等质谱分析前阶段因素有可能会影响鉴定结果[2-3，13]，例如菌株重复传代培养会导致其无法被鉴定。因此，在常规工作中应该对首次无法鉴定的菌株进行重复检测。而那些虽然包含在数据库中但在重复检测中依然未被鉴定出来的菌株，很可能是由于其产生的图谱与数据库中的特征图谱不一致。

Couturier等[19]的研究发现，使用Bruker固有的数据库，93%的菌株至少能被鉴定到属的水平，只有66%的菌株能被鉴定到种的水平。而通过对数据库进行自定义补充后，所有的菌株能被鉴定到属的水平，79%的菌株能被正确鉴定到种的水平。研究者把上述现象归结于：仪器生产商数据库中生物个体单一的参考光谱并不能代表其他实验室分离的典型菌株，也就是说菌株的多样性影响了鉴定的准确性。因此，数据库中较多的参考光谱可使鉴定结果更为可靠。可见，图谱数据库的组成和质量对质谱仪的正确鉴定至关重要，这与本研究结果基本一致。

针对单一的MALDI-TOF-MS鉴定系统和传统鉴定方法进行比较的研究较多，直接对两种MALDI-TOF-MS系统进行比较和评估的研究还较少。Chen等[20]报道了BrukerBiotyper和VitekMSIVD系统采用MALDISepsityper蛋白质提取法对181株（代表20个菌属和40个菌种）来自血培养物的细菌的直接鉴定，经统计分析，P=0.016，总体上Bruker Biotyper系统（97.8%）的正确鉴定水平高于Vitek MSIVD系统（92.3%）。

为提高MALDI-TOF-MS对细菌的鉴定能力，仪器制造商有必要对图谱数据库逐步完善，使其涵盖尽量多的菌属和菌种。此外，考虑到菌株标本来源多样性、地域来源差异性和不同分离年限，数据库中应包含同一个菌种采集的多个分离株的图谱，并允许用户将本地分离的典型菌株作为参考菌株填充到自定义数据库中，对数据库进行最有效的补充，以便更大地发挥其鉴定作用。

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（2014-07-22收稿 2014-09-03修回）

（责任编委 曲 芬 本文编辑 王 姝）

Com parison of Bruker Biotyper system and Vitek MS system in the identification of clinical Gram-negative isolates

WANG Lu,YANG Liu,RENWei,CHU Mei-ling,MENG Dong-ya,XUEWen-cheng*
Department of Laboratory,General Hospital of Shenyang Military Area Command,Shenyang,Liaoning 110016,China
*Corresponding author,E-mail:13309884078@189.cn

Objective To compare and evaluate the use of twomatrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry(MALDI-TOF-MS)systems,Bruker MALDIBiotyper system(Bruker Biotyper system)and MALDI-TOF Vitek MS system(Vitek MS system)in the identification of Gram-negative clinical isolates.Methods A total of 120 Gram-negative isolates were collected from blood,urine,cerebrospinal fluid,secretion,wound swab and sputum samples from patients treated in General Hospital of Shenyang Military Area Command from Mar.2012 to Jan.2013.Each isolate was firstly identified to the species by Vitek 2 Compact system,and then identified by Bruker Biotyper system and Vitek MSsystem.Isolates differently identified by the three systemswere finally confirmed by 16S rDNA sequencing as the gold standard.Results Of the 120 isolates,95.0%were correctly identified to thegenus levelby Bruker Biotyper system and 92.5%by Vitek MSsystem,and 89.2%were correctly identified to the species level by Bruker Biotyper system and 86.7%by Vitek MSsystem,and the differencesbetween them were notsignificant.Conclusions Bruker Bio-typersystem and Vitek MSsystem were notsignificantly different in the accuracy ratesof identifying clinicalGram-negative isolates. In addition,the identification resultsof the two systemsare closely related to theirown databasesofpictorialworks.

spectrometry,mass,matrix-Assisted laser desorption-ionization;pictorialworks;Gram-negative bacteria

R313

A

1007-8134(2014)05-0282-05

110016，沈阳军区总医院检验科（王璐、杨柳、任微、褚美玲、孟冬娅、薛文成）

薛文成，E-mail:13309884078@189.cn