快速检测IL-28B rs12979860基因多态性双色荧光PCR法的建立

刘立明，李永利，马洪滨，王雪飞，王嫣，王志富，毛远丽，王海滨

·论著·

快速检测IL-28B rs12979860基因多态性双色荧光PCR法的建立

刘立明，李永利，马洪滨，王雪飞，王嫣，王志富，毛远丽，王海滨

目的建立一种适合临床常规检测白细胞介素28B（interleukin-28B,IL-28B）rs12979860基因多态性的快速实验方法。方法随机收集我院223例丙型肝炎住院患者外周血标本，设计针对IL-28B rs12979860基因多态性位点的特异性引物和荧光探针，直接通过双色荧光PCR法检测IL-28B rs12979860基因多态性，以基因测序法进行验证，同时初步探讨IL-28B rs12979860不同基因型在本研究人群中的分布频率。结果双色荧光PCR法能很好地鉴别IL-28B rs12979860 3种基因型，与测序法结果一致率为100%。IL-28B rs12979860基因多态性中T/T、C/T和C/C基因型在本研究人群中的分布频率分别为1.79%（4/223）、23.32%（52/223）和74.89%（167/223）。结论根据IL-28B rs12979860单核苷酸多态性基因型特异性探针和引物所建立的双色荧光PCR法能快速有效地进行rs12979860基因多态性分型，方法快速、可靠，为丙型肝炎患者抗病毒个体化治疗效果的预测提供了一种有效的检测方法。

白细胞介素-2；丙型肝炎；多态现象，单核苷酸；基因型

HCV感染是引起全球慢性肝病的主要原因之一，全球慢性丙型肝炎（丙肝）患者占全世界人口的3%[1]，我国HCV感染率约为3.2%，每年新发丙肝病例约3.5万例[2]。在使用聚乙二醇干扰素（pegylated interferon,Peg-IFN）和利巴韦林（ribavirin,RBV）联合抗病毒治疗过程中有近50%的基因1型HCV感染者及近20%的基因2、3型HCV感染者未能获得持续病毒学应答（sustained virological response,SVR）（即治疗结束随访24周时，定性检测HCV RNA阴性或定量检测小于最低检测限）[3]。研究发现这种差异除了与HCV载量、基因型别等因素有关外，还与宿主的白细胞介素28B（interleukin-28B,IL-28B）基因多态性高度相关[4-5]。

本研究根据IL-28B rs12979860基因多态性序列设计特异性引物及荧光探针，通过单管双色荧光PCR法检测rs12979860基因多态性，以期为临床预测丙肝抗病毒治疗效果提供有效依据。

1 材料与方法

1.1 材料随机选择2012年我院223例丙肝住院患者，用EDTA抗凝管采集其外周血，-20℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 引物设计参照GenBank中单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）rs12979860基因序列，采用Vector NTI 11.0软件设计针对rs12979860CTSNP位点的双色（FAM和VIC通道）特异性荧光MGB探针引物和PCR反应体系引物。

1.2.2 基因组DNA提取采用凯杰公司的基因组DNA提取试剂盒，参照使用说明书提取患者外周血基因组DNA，用紫外分光光度计测定DNA含量，然后于-80℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增

1.2.3.1 PCR扩增体系10μl模板+40μl PCR反应液（含探针、引物、Taq酶、DNTP以及缓冲液）构成50μl反应体系上机扩增。

1.2.3.2 PCR扩增程序95℃5min，93℃10 s，61℃30 s，40个循环，其中61℃时荧光采集。

1.2.3.3 结果判读根据典型的特异性扩增曲线判读相应型别，FAM扩增为T/T型，VIC（HEX）扩增为C/C型，若二者均呈指数扩增为C/T型。

1.2.4 DNA测序验证将应用双色荧光PCR法检测结果为C/C、T/T和C/T型的20份基因组DNA外送上海桑尼生物科技有限公司，要求另外设计测序引物对目标序列rs12979860CTSNP位点进行测序检测，最终通过2种方法的双盲比对结果的一致性分析来说明采用双色荧光PCR法检测IL-28B rs12979860基因多态性结果的正确性。

1.3 统计学处理运用SAS9.0软件，对测序法和双色荧光PCR法检测的结果进行Kappa一致性检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 双色荧光PCR法IL-28B rs12979860 SNP分型结果在223例丙肝患者中，通过双色荧光PCR法检测IL-28B rs12979860基因多态性以C/C基因型为主（表1）。

表1 223例丙型肝炎患者标本IL-28B rs12979860基因分型Table 1 IL-28B rs12979860 genetypes of 223 patientsw ith hepatitis C

2.2 测序法IL-28B rs12979860CT SNP检测结果

另外设计测序引物对20份样本目标序列rs12979860CT SNP位点进行测序检测，结果显示IL-28B rs12979860CTSNP位点3种基因型的测序结果差异明显，其中C/T混合型由于2种碱基混合造成套峰现象（图1）。

2.3 双色荧光PCR法与测序法比较应用Kappa一致性检验对2种方法结果进行一致性分析，Kappa＝1，表明2种方法检测结果之间的一致性具有统计学意义，一致率为100%（表2）。

图1 IL-28B rs12979860 SNP测序结果Figure 1 Genotypes of IL-28B rs12979860 SNP by sequencing method

表2 双色荧光PCR法与测序法IL-28B rs12979860 SNP分型的一致性(份)Table 2 Consistence of the genotyping results in IL-28B rs12979860 site between two-color fluorescent PCR and sequencing method(sam ples)

3 讨论

近年来，随着分子生物学技术和SNP检测技术的发展，丙肝个体化治疗方面的研究取得了长足进展。2011年，欧洲肝脏研究学会在《丙型肝炎诊治指南》[6]中首次明确IL-28B基因多态性在抗HCV治疗中预测SVR的临床应用价值。Tanaka等[7]发现，rs12979860多态性与Peg-IFN和RBV联合治疗的效果显著相关。研究发现，rs12979860位点和rs8099917位点与抗HCV疗效相关性最强，不同种族的丙肝患者应用IFN联合RBV治疗后，获得的SVR率与rsl2979860 C等位基因频率呈正相关，东亚裔获得的SVR率远高于非洲裔，欧洲裔和西班牙裔居中[8-11]。据Lange和Zeuzem[12]报道，HCV基因1、4型患者中，IL-28B保护性变异即SNP rs12979860 C/C型患者获得的SVR率比T/T型高2倍；HCV基因2、3型丙肝患者中SVR变化较小。但近年来有研究报道，IL-28B可用于预测未获得快速病毒学应答的基因2、3型患者的SVR率[3，13]。以上研究成果表明，在抗病毒治疗前，确定IL-28B rs12-979860基因型对预测HCV感染者治疗应答率、提高治疗耐受性、制订个体化治疗方案至关重要[14]。

本研究设计针对IL-28B rs12979860基因多态性的特异性双色荧光探针和PCR扩增引物，构建了单管双色荧光PCR法，对rs12979860不同基因型能够快速、有效地进行鉴别。此外，通过对应用本方法检测结果为C/C、T/T、C/T型的20份基因组DNA另外设计测序引物，对目标序列rs12979860CTSNP位点进行双盲测序检测，Kappa一致性检验显示双色荧光PCR法与测序法的一致率为100%，说明本研究建立的双色荧光PCR法在检测IL-28B rs12979860基因多态性方面的可靠性和准确性与测序法同效。Thomas等[10]发现，非HCV感染者中IL-28B rs12979860基因多态性C/C基因型分布频率欧洲裔为52.8%～85.7%，非洲裔为23.1%～54.8%，包括中国、日本和东南亚的东亚裔人群为90%～100%。自发清除HCV的患者中，欧洲裔HCV感染者C/C、C/T和T/T基因型分布频率分别为51.8%、27.8%和31.4%，非洲裔HCV感染者分别为55.2%、33.0%和20.8%。慢性HCV感染者中，欧洲裔C/C、C/T和T/T基因型分布频率分别为48.2%、72.2%和68.6%，非洲裔分别为44.8%、67.0%和79.2%[15]。本研究223例丙肝住院患者C/C、C/T和T/T基因型分布频率分别为74.89%（167/223）、23.32%（52/223）和1.79%（4/223）。这一结果介于Thomas等[10]报道的非HCV感染者与自发清除HCV患者的分布频率之间，可能与本研究样本为东亚丙肝患者的民族属性有关，提示中国人群HCV感染者IL-28B rs12979860 C/C、C/T和T/T基因型分布频率与欧洲裔和非洲裔患者相比，保护型C/C基因型分布频率较高。

目前大部分研究机构IL-28B rs12979860基因多态性的鉴别主要采用基因测序、基因芯片、酶切等方法，费时费力，所需仪器设备多且昂贵，难以在普通医院普及。本检测方法从核酸提取到报告结果，所需时间不到1.5 h，具有操作简单、PCR扩增快、特异性强、分辨率高、省时省力、结果准确和无污染等优点，适合临床常规快速检测。

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（2014-05-27收稿2014-07-22修回）

（责任编委王永怡本文编辑王姝）

Establishing a rapid two-color fluorescent PCR method for detecting the IL-28B(rs12979860)gene polymorphism s

LIU Li-ming,LIYong-li,MA Hong-bin,WANG Xue-fei,WANG Yan,WANG Zhi-fu,MAO Yuan-li*,WANG Hai-bin*
Clinical Laboratory Center,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China
*Corresponding author.MAO Yuan-li,E-mail:maoyuanlee@163.com;WANG Hai-bin,E-mail:sab-sm@hotmail.com

Objective To establish a rapid method suitable for routine clinical detection of interleukin(IL)-28B rs12979860 gene polymorphisms.M ethods A total of 223 peripheral blood samples from hospitalized patients with hepatitis C in our hospital were random ly collected.The specific primers and fluorescent probe sequences in the sites of IL-28B rs12979860 gene polymorphismswere designed,and IL-28B rs12979860 gene polymorphismswere detected by two-color fluorescent PCR directly,and validated by gene sequencing method.The frequencies of different HCV IL-28B rs12979860 genotypes in this population were discussed as well.Results The two-color fluorescent PCR technology could identify 3 genotypes of IL-28B rs12979860 single nucleotide polymorphisms,achieving 100%consistencewith sequencingmethod.The frequencies of T/T,C/T and C/C genotypes in IL-28B rs12979860 gene polymorphisms were 1.79%(4/223),23.32%(52/223)and 74.89%(167/223),respectively.Conclusions The two-color fluorescent PCR technology based on the specific probe and primer of IL-28B rs12979860 single nucleotide polymorphisms is effective,rapid and reliable in identifying genotypes of rs12979860 gene polymorphisms.It is an effective detectionmethod for the prediction of antiviral individualized treatment in patients with hepatitis C.

interleukin-2;hepatitis C;polymorphism,single nucleotide;genotype

R392.114；R512.63

A

1007-8134(2014)05-0279-03

军队“十二五”面上项目（CWS11J298）

100039北京，解放军第三〇二医院临床检验医学中心（刘立明、李永利、马洪滨、王雪飞、王嫣、王志富、毛远丽、王海滨）

毛远丽，E-mail:maoyuanlee@163.com；王海滨，E-mail: sab-sm@hotmail.com