二硝基氯苯致敏溃疡性结肠炎大鼠细胞因子活性研究*

朱慧敏，朱杭溢，裘生梁，陈 武，宋利斌，陈 超，叶涵婷，朱曙东

(1、浙江省永康市机关卫生所，永康321300;2、浙江省永康市中医院，永康321300;3、浙江中医药大学，杭州310053)

二硝基氯苯致敏溃疡性结肠炎大鼠细胞因子活性研究*

朱慧敏1，朱杭溢2，裘生梁3，陈 武2，宋利斌3，陈 超3，叶涵婷3，朱曙东3

(1、浙江省永康市机关卫生所，永康321300;2、浙江省永康市中医院，永康321300;3、浙江中医药大学，杭州310053)

目的:探讨二硝基氯苯(DNCB)致敏联合醋酸灌肠法对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠细胞因子的影响。方法:采用二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法及醋酸灌肠法对SD大鼠进行溃疡性结肠炎造模，并做对比研究。SD大鼠随机分为复合造模组、醋酸造模组、空白对照组。空白组作为各项指标对照，各组均予生理盐水灌胃治疗，分别在第1、15和29 d取样观测大鼠的一般情况变化、结肠组织黏膜损伤评分(CMDI)、病理组织学评分(TDI)，检测血清IL－2、IL－4、IL－6、IL－10、IL－17、IL－23等细胞因子水平，并对各组细胞因子与黏膜评分及病理评分进行相关性比较。结果:IL－2:与对照组比较，复合组(第1 d、第15 d)和醋酸组(第1 d)显著降低;而复合组第15 d与醋酸组第15 d比较显著降低。IL－6:与对照组及醋酸组(第1 d)比较，复合组(第1 d)显著升高。IL－10:与对照组比较，复合组(第1 d、第15 d)和醋酸组(第1 d、第15 d、第29 d)显著降低;IL－17:与对照组比较，复合组(第1 d、第15 d)和醋酸组(第1 d)显著降低;而醋酸组(第15 d)与复合组(第15 d)比较显著升高。CMDI:与对照组比较，各组均有显著升高。TDI:与对照组比较，醋酸(第1 d)、复合(第1 d)有显著升高。相关性:IL－2、IL－10、IL－17与CMDI明显相关;IL－2与TDI明显相关。结论:二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法及醋酸灌肠法均能造成SD大鼠溃疡性结肠炎，与醋酸灌肠法比较，二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法有可能通过下调IL－2，上调IL－6、IL－17，从而加重和延长大鼠免疫紊乱的状态。

溃疡性结肠炎，大鼠，IL－2，IL－6，IL－10，IL－17

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种病因、发病机理未明的炎症性肠病。其病变主要位于结肠的黏膜层，以溃疡为主，多累及直肠和远端结肠，以腹泻、脓血便、腹痛和里急后重为主要表现。我国近年发病率呈上升趋势［1，2］。目前溃疡性结肠炎动物模型有多种，因物种、造模方式不同，在致病因素、病理生理过程、免疫反应、临床表现等方面可产生明显差异。因此对其机理进行探索十分必要。本实验选取二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法及醋酸灌肠法对SD大鼠进行溃疡性结肠炎造模，并进行对比研究。期望揭示二硝基氯苯致敏对溃疡性结肠炎动物模型造成的影响。

1 材料

1.1 实验动物清洁级SD大鼠78只，雌性，体重(185±9.31)g:浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂和仪器乙酸(上海强顺化学试剂有限公司，批号20110415);乙醇(杭州高晶精细化工有限公司，批号20111029);2，4－二硝基氯苯(鹏林试剂);戊巴比妥钠(浙江中医药大学动物实验中心提供，ID: 24898448);大鼠IL－2、IL－4、IL－6、IL－10、IL－17、IL－23检测试剂盒(杭州力拓生物技术有限公司，批号201205)。酶标仪(ELX808美国Bio－Tck公司);离心机(C4－12法国Jovan);双目显微镜(XSZ－H重庆光学仪器厂);超低温冰箱(ELT－13V－85V34美国HARIS公司)。

2 方法

2.1 造模药剂制备戊巴比妥钠5 g溶于167 ml生理盐水中，制备成3%戊巴比妥钠溶液;2，4－二硝基氯苯6 g加入300 ml丙酮，制备成2%2，4－二硝基氯苯丙酮溶液;2，4－二硝基氯苯0.03 g加入30 ml (50%)乙醇中，制备成0.1%2，4－二硝基氯苯乙醇溶液;100%醋酸直接稀释到10%;40%福尔马林稀释成10%福尔马林溶液。

2.2 动物分组、造模及给药

2.2.1 分组随机分为空白对照组(normal control group)10只、复合组(DNCB UC model)35只、醋酸组(acetic UC model)33只。

2.2.2 溃疡性结肠炎大鼠动物模型造模及给药除空白组外全部大鼠颈背部用脱毛膏脱毛。复合组大鼠连续2周以2%二硝基氯苯丙酮滴背(脱毛处)，1次/d，每次每只0.3 ml，第15 d用灌胃针缓慢插入结肠约8 cm，注入0.1%二硝基氯苯乙醇0.25 ml，第16 d同部位注入10%醋酸1 ml，准确定时15 s后用5 ml生理盐水冲洗;醋酸组连续2周以生理盐水滴背(脱毛处)，1次/d，每次每只0.3 ml，于第16 d用灌胃针缓慢插入结肠约8 cm，注入10%乙酸1 ml，准确定时15 s后用5 ml生理盐水冲洗3次;空白对照组第15 d用灌胃针缓慢插入结肠约8 cm，注入生理盐水0.25 ml，第16 d同部位注入生理盐水1 ml，准确定时15 s后用5 ml生理盐水冲洗。各组给予生理盐水模拟治疗，1次/d，每次每只2 ml。

2.3 指标检测

2.3.1 标本采集与处理造模1 d后复合组、醋酸组每组随机各取10只大鼠，加上空白对照组10只大鼠，进行标本采集与处理;造模15 d及29 d后复合组、醋酸组随机各取10只大鼠，进行标本采集与处理。用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，心脏取血2 ml，迅速注入肝素抗凝管内，送做细胞因子检测。游离结肠组织，剖取回肠末段及全结肠，沿肠系膜纵轴剖开，冰生理盐水清洗，肉眼观察结肠大体形态、并对结肠黏膜损伤进行积分比较，然后取病变最明显处组织2 cm经10%福尔马林固定24 h后做病理切片。

2.3.2 观测指标

2.3.2.1 一般情况饮食、体重、皮毛、精神状态、大便性状等。

2.3.2.2 病理组织学评分标准每只大鼠总评分为“上皮细胞”评分+“炎症细胞浸润”评分。上皮细胞:正常形态，0分;有杯状细胞丢失，1分;杯状细胞大面积丢失，2分;隐窝细胞丢失，3分;隐窝细胞大面积丢失，4分。炎症细胞浸润:没有浸润，0分;浸润在隐窝基底层，1分;浸润到达黏膜肌层，2分;浸润到黏膜肌层，伴随黏膜增厚和明显水肿，3分;浸润到达黏膜下层，4分。

2.3.2.3 结肠黏膜损伤积分按结肠组织形态学评分标准［3］。无损伤，0分;黏膜充血、水肿，未出现溃疡，1分;黏膜充血、水肿、轻度糜烂，未出现溃疡，2分;黏膜充血、水肿、中度糜烂，有单个溃疡，3分;黏膜充血、水肿、高度糜烂，有多个溃疡，4分;黏膜充血、水肿、重度糜烂，有大于1 cm2溃疡，5分。

2.4 数据处理计量资料以均数±标准差(¯x±s)表示，并用SPSS 13.0 for Windows软件统计包对各组数据进行统计分析，组间资料用单因素方差分析，采用LSD检验方法，结肠组织黏膜损伤评分和病理组织学评分用秩和检验;以P＜0．05为有显著差异，P＜0.01为有非常显著差异。相关性用Spearman's rho检验，相关系数绝对值大于0.7以上，则具有相关意义。

3 结果

3.1 一般情况复合组滴背约1周后，大鼠表现烦躁，反抗性强，滴背处皮肤表层变硬，继而因大鼠间的抓挠，导致硬的表皮层脱落，出现出血点、溃烂。空白组即出现大便颜色变浅、便质变溏变烂，甚至出现糊状便，少数可见黏液便甚至黏液血便。空白对照组大鼠大便未见异常。灌胃后第4～5 d，复合组、醋酸组便质亦有所改善，但仍出现稀便。复合组滴背处皮肤溃烂情况逐渐好转，无出血点，破溃处逐渐愈合。

3.2 结肠黏膜损伤及病理组织学评分正常大鼠结肠黏膜上皮细胞完整，腺体排列整齐;UC大鼠可见出血、坏死，溃疡形成，隐窝细胞排列紊乱，腺体扩张，水肿出血，并可见大量炎症浸润。见表1和图1。

表1 黏膜组织损伤和病理评分

3.3 细胞因子检测结果见表2。

3.4 相关性比较结果IL－2与病理组织学评分(r=－0．845)及黏膜损伤评分(r=－0．817)呈负相关。IL－10与黏膜损伤评分(r=－0．767)呈负相关。IL－17与黏膜损伤评分(r=0.817)呈正相关。

图1 病理图片(HE染色×100)

表2 血清细胞因子水平

4 讨论

本实验采用的二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法的特点是模拟人类免疫致敏过程，导致迟发性变态反应造成肠黏膜的损伤，达到全身免疫异常与局部炎症病变的结合。溃疡性结肠炎的病因和发病机制目前尚未明确，在其发病中，免疫紊乱扮演了重要角色。而免疫紊乱过程中，细胞因子参与的免疫反应和炎症过程是目前的研究热点。

IL－2主要由辅助性T淋巴细胞在抗原或有丝分裂原刺激和IL－1诱导下合成分泌，与T细胞、B细胞、单核细胞表面的IL－2受体结合后，能引起T细胞活化、增殖，促进细胞毒T细胞的杀伤作用，增强NK细胞活性，促进B细胞分泌等细胞免疫反应。研究发现［4］，与正常人比较，UC患者活动期IL－2水平最低，缓解期次之，提示UC发病机制可能和血清IL－2降低密切相关。本次实验发现，与单纯醋酸灌肠法比较，二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法能延长对大鼠血清IL－2的下调作用。同时IL－2与病理组织学评分及黏膜损伤评分呈显著负相关。

IL－6是一种作用广泛的促炎性因子，其促炎性作用包括:①促进B细胞活化、增生并最终分化为浆细胞，增加免疫球蛋白合成。②促进T细胞增殖、刺激细胞毒性T细胞反应。③激活G0期造血干细胞进入G1期，使粒细胞、单核细胞和巨噬细胞增殖。④在体内外均可诱导肝细胞生成急性期蛋白。一系列研究发现溃疡性结肠炎患者血清IL－6浓度明显升高，且与病变范围和病变严重程度成正相关［5－7］。本次研究发现，二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法能升高大鼠血清IL－6的表达，而单纯醋酸灌肠法则不明显。

IL－10是一种具有抑制炎症反应，对维持细胞网络平衡起到免疫调节作用的细胞因子，可抑制多种细胞的合成及释放炎症前细胞因子，发挥其抗炎作用。研究发现［8－10］，活动期UC患者无论结肠黏膜还是血清中IL－10的表达较对照组低，且与病情的严重程度有关。本次研究发现，二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法和单纯醋酸灌肠法均可明显降低大鼠血清IL－10的表达。同时IL－10与黏膜损伤评分呈负相关。

IL－17是一种强大的前炎症细胞因子，也是炎症反应的微调因子。研究发现［11－13］，T细胞和单核/巨噬细胞是UC患者炎症局部IL－17的来源。这与IL－17的生物学特性一致，并证实了IL－17表达与疾病活动指数呈正相关，局部IL－17浓度的高低也反映了UC疾病炎症的严重程度。本次实验发现，与单纯醋酸灌肠法比较，二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法能延长对大鼠血清IL－17的上调作用。IL－17与黏膜损伤评分呈显著正相关。

总之，二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法及醋酸灌肠法均能造成SD大鼠溃疡性结肠炎，与醋酸灌肠法比较，二硝基氯苯致敏联合醋酸灌肠法有可能通过下调IL－2，上调IL－6、IL－17，从而加重和延长大鼠免疫紊乱的状态。本次研究还初步发现IL－2、IL－10及IL－17与病理组织学评分和(或)黏膜损伤评分显著相关，能直接反映黏膜炎症程度。

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Effect of 2，4dinitrobenzene- 1-chlorobenzene in ulcerative colitis rats

Zhu Huimin1，Zhu Hangyi2，Qiu Shengliang3，Chen Wu2，Song Libing3，Chen Chao3，Ye Hanting3，Zhu Shudong3
(1.Yongkang Authorities Clinic，Yongkong 321300;2.Yongkang Hospital of Traditional Chinese Medicine，Yongkong 321300;3. Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310053)

Objective:To observe therapeutic effect and mechanism of 2，4－dinitrobenzene－1－chlorobenzene(DNCB)in rat ulcerative colitis(UC)model.Method:78 SD rats were randomly divided into 3 groups:normal control(n=10)，DNCB UC model (n=35)，acetic UC model(n=33).The rats of DNCB UC model group was established by an enema of DNCB and acetic acid. The rats of acetic UC model group was established by an enema of acetic acid.The rats were sampled in batches when 1 d，15 d and 29 d.the colon mucosal damage index(CMDI)and tissuedamage index(TDI)were evaluated，the serum levels of interleukin－2(IL－2)，IL－4，IL－6，IL－10，IL－17 and IL－23were determined by enzyme－linked immunosor－bant assay(ELISA).The descriptive and correlational analyses were conducted.Results:Compared with normal control group，DNCB UC model(1 d，15 d) IL－2 declined significantly，IL－17 increased significantly.Compared with DNCB UC model(15 d)，acetic UC model(15 d)IL－2 increased significantly，IL－17 declined significantly.Compared with normal control group，DNCB UC model IL－6 increased significantly.Compared with normal control group，DNCB UC model(1 d，15 d)and acetic UC model(1 d，15 d，29 d)IL－10 declined significantly.Compared with normal control group，both CMDI and TDI were increased significantly in DNCB UC model and acetic UC model.Conclusion:Immune dysfunction is one of causes resulting in colonic inflammatory damage by enema of DNCB and acetic acid.These occurrences are intimatly related to cytokine level of IL－2，IL－6，IL－10，IL－17.

DNCB，ulcerative colitis，rat，IL－2，IL－6，IL－10，IL－17

R965

A

1006－5687(2014)02－0006－05

2013－12－24

2011浙江省金华市科学技术研究计划项目(No.2011－033－088)