HPLC法测定凉血消风汤中绿原酸的含量*

寇咏梅，贺江萍，郭晓霞

(1.天津市第二医院，天津300141;2.天津医科大学，天津300070)

HPLC法测定凉血消风汤中绿原酸的含量*

寇咏梅1，贺江萍2，郭晓霞1

(1.天津市第二医院，天津300141;2.天津医科大学，天津300070)

目的:建立高效液相色谱(HPLC)法测定凉血消风汤中绿原酸含量。方法:采用外标法。Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱为固定相，乙腈－0.4%磷酸溶液(13∶87)为流动相，检测波长为327 nm，流速为1.0 ml/min。结果:线性范围为4.0～40.0 μg/ml(r=0.999 1)，平均加样回收率为101.0%，RSD为1.9%(n=6)。结论:本方法专属性强，精密度和稳定性良好，结果准确，可用于凉血消风汤的质量控制方法。

高效液相色谱，绿原酸，凉血消风汤，含量测定

凉血消风汤是由生地、元参、白茅根、金银花、生石膏、荆芥、防风、知母等11味中药加工制成的中药制剂，具有凉血清热疏风的功效，用于风热外袭、入里化热的病机，治疗脂溢性皮炎、荨麻疹、玫瑰糠疹等症。本院临床应用多年，效果较好。绿原酸作为金银花的主要成分之一，也是凉血消风汤的主要有效成分，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。为了完善凉血消风汤的质量控制标准，以绿原酸作为定量指标具有重要意义。参考相关文献［1－3］，本实验建立了高效液相色谱法测定凉血消风汤中绿原酸的含量，为该方的质量控制提供客观的评价方法，同时也为该药的剂型改进奠定了理论依据。

1 仪器与试药

1.1 试药绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110753－200413，供含量测定用);凉血消风汤(本制剂中心制备，批号120904、130401、130428);乙腈为色谱纯;其他试剂均为市售分析纯，重蒸水自制。

1.2 仪器6000 LDI型高效液相色谱仪(美国COMETRO公司)，6000PVW UV/VIS紫外检测器(美国COMETRO公司)，EZChrom Elite分析工作站，AX205十万分之一天平(瑞士梅特勒－托利多公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱Hypersil ODS2(250 mm× 4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈－0.4%磷酸溶液(13∶87);检测波长:327 nm;流速:1.0 ml/min;柱温: 30℃;进样量:10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取对照品2.0 mg，置50 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml含40 μg的对照品溶液，10℃以下保存。

2.2.2 供试品溶液的制备取样品适量，混匀，精密量取1 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，超声处理5 min，放冷至室温，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备根据处方组成，除金银花外的其余药味按制剂工艺制备，制得缺金银花的阴性样品。按“2.2.2”项下方法处理制得阴性对照溶液。

2.3 系统适用性按照“2.1”项下色谱条件，取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液10 μl分别进样，在该色谱条件下，阴性样品溶液在绿原酸峰的位置上没有干扰，见图1。

图1 绿原酸对照品(A)供试品(B)阴性对照(C)HPLC色谱图

2.4 线性关系精密吸取绿原酸浓度为40 μg/ml的对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀。按照“2.1”项下色谱条件分析，进样10 μl，记录峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标、浓度(X)为横坐标进行线性回归，得绿原酸的回归方程分别为:Y=239 981X+ 34 149(r=0．999 1)，在4.0～40 μg/ml范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验精密量取对照品溶液10 μg/ml，按照“2.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，测得绿原酸峰面积，计算得其RSD为1.44%。

2.6 重复性试验取同一批供试品溶液6份，按照“2.1”项下色谱条件分析，测得绿原酸峰面积为0.338 6 mg/ml，RSD为1.17%。

2.7 稳定性试验取同一批供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、6、8和12 h进行测定，测得绿原酸峰面积为0.339 0 mg/ml，RSD为1.22%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验精密量取1 ml已知绿原酸含量0.338 2 mg/ml的供试品溶液6份，分别置50 ml量瓶中，精密加入0.338 mg对照品，按照“2.2.2”项下方法制备供试溶液，按照“2.1”项下色谱条件分析，计算其平均回收率101.0%，RSD为1.9%，结果见表1。

表1 绿原酸加样回收率试验结果

2.8 样品测定取3批样品，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μl，按照“2.1”项下色谱条件分析，按外标法计算绿原酸含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

绿原酸经紫外扫描可知，最大吸收波长为327 nm，故选择最大吸收波长为检测波长。绿原酸易溶于甲醇、乙醇，在提取过程中考查了以50%甲醇、80%甲醇、无水乙醇和稀乙醇为溶剂，分别进行超声5 min和20 min、回流提取30 min，流动相乙腈－0.4%磷酸溶液(13∶87)、乙腈－0.1%磷酸溶液(10∶90)［4，5］。结果发现，以50%甲醇超声提取5 min即达到效果，样品回收率高，并且方法简便快捷，易于操作。

本制剂为复方制剂，成分较多，参照2010版《中国药典》［6］以乙腈－0.4%磷酸溶液(13∶87)为流动相分离度较好，可用于凉血消风汤中绿原酸的定量分析。本研究将为凉血消风汤质量标准的进一步完善提供科学依据。

1杨静，高文远.HPLC法测定乳疮丸中绿原酸的含量［J］.天津药学，2010，22(3):16－18

2余琼，张玉萍，方步武.蒿鳖养阴软坚方中虎杖苷的含量测定［J］.时珍国医国药，2010，4(13):36－37

3李云贵，李冲，文翔昊，等.高效液相色谱法测定小儿肺热咳喘口服液中绿原酸与木犀草苷的含量［J］.中南医学科学杂志，2013，41(4): 422－424

4薛士荣，李玉芳，孙燕燕.高效液相色谱法测定小儿清化丸中绿原酸和芍药苷的含量［J］.天津药学，2011，23(5):9－16

5丁兆猛.高效液相色谱法测定蓝芩口服液中绿原酸和栀子苷的含量［J］.临床合理用药杂志，2011，4(13):36－37

6中国药典［S］.一部.2010:205

Determination of chlorogenic acid in Liangxue Xiaofeng Tang by HPLC

Kou Yongmei1，He Jiangping2，Guo Xiaoxia1
(1.Tianjin Second Hospital，Tianjin 300141;2.Medical University of Tianjin，Tianjin 300070)

Objective:To establish an HPLC method for determination of chlorogenic acid in Liangxue Xiaofeng Tang.Methods: An external method with Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)column as fixed phase and acetonitrile－0.4%phosphoric acid(13∶87)as mobile phase was adopted.The detection wave length was 327 nm.The flow rate was 1.0 ml/min.Results:The linearity range was 4.0～40 μg/ml(r=0.999 1)，The average recovery was 101.0%，RSD was 1.9%(n=6).Conclusion:The method is simple，rapid and reliable.So it can be used as quantitativc determination for quality control of Liangxue Xiaofeng Tang.

HPLC，chlorogenic acid，Liangxue Xiaofeng Tang，determination

R927.2

A

1006－5687(2014)02－0020－02

2014－01－18