双波长HPLC同时测定清营颗粒中绿原酸与甘草酸铵含量*

郑 敏

(天津市北辰区药品检验所，天津300400)

双波长HPLC同时测定清营颗粒中绿原酸与甘草酸铵含量*

郑 敏

(天津市北辰区药品检验所，天津300400)

目的:建立HPLC法测定清营颗粒中绿原酸和甘草酸铵的含量。方法:采用高效液相色谱法，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱;检测波长为254 nm(甘草酸铵)和327 nm(绿原酸)，柱温:40℃;流速:1.0 ml/min;进样量:10 μl。结果:绿原酸在7.5～50 μg范围内线性良好(r=0．999 9，n=5)，甘草酸铵在4.5～30 μg范围内线性良好(r=0．999 9，n=5)，平均回收率分别为100.3%和100.5%，RSD分别为1.3%和1.6%。结论:本法操作简便，重现性好，可有效控制该制剂质量。

高效液相色谱法，清营颗粒，绿原酸，甘草酸铵

清营颗粒是本市某医院制剂品种，该制剂由金银花、赤芍、大黄、甘草等11味药组成，具有清热凉血、逐瘀消肿的功效。金银花和甘草是该处方中的主要组分，其主要有效成分分别为绿原酸和甘草酸铵，该药现有质量标准无含量测定项，现采用双波长HPLC同时测定清营颗粒中绿原酸和甘草酸铵双组分的含量，该方法操作简便，重现性好，可以有效控制该制剂的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器日本SHIMADZU LC－2010AHT高效液相色谱仪，LC solution工作站。色谱柱:DiamonsilTM C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);赛多利斯BP211D电子天平;岛津UV2450型紫外－可见分光光度计。

1.2 试药绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110753－200413);甘草酸铵对照品(中国药品生物制品检定所，批号110731－201116)。样品(本市某医院提供，批号20130510、20130511、20130520;规格:10 g/袋)。甲醇、乙腈为色谱级;水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件流动相:以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱;检测波长为254 nm(甘草酸铵)和327 nm(绿原酸)，柱温为40℃，流速为1.0 ml/min，进样量10 μl［1－3］。理论板数按绿原酸峰计算应不低于3 000。

表1 梯度洗脱系统

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液分别称取绿原酸对照品和甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 ml含绿原酸25 μg/ml和甘草酸铵15 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取“装量差异”项下的内容物，研细，取约1 g，精密称定，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理30 min(功率300 W，频率40 kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按处方比例及制法制成不含金银花和甘草的阴性样品，再按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法，制得阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液和混合对照品溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样，结果甘草酸铵与绿原酸分离度为17.1，符合《中国药典》要求。结果见图1。

2.4 标准曲线的制备取绿原酸和甘草酸铵对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml中分别含绿原酸7.638、12.73、25.46、38.19和50.92 μg及含甘草酸铵4.785、7.975、15.95、23.92和31.90 μg的混合溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得绿原酸回归方程:Y=39 471．3X+11 424．7(r= 0．999 9，n=5);求得甘草酸铵回归方程Y=23 521．7 X+1 818．8(r=0．999 9，n=5)。结果表明绿原酸在7.638～50.92 μg范围内线性良好，甘草酸铵在4.785～31.9 μg范围内线性良好。

2.5 精密度试验取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，分别测定对照品溶液中绿原酸和甘草酸铵峰面积，测得绿原酸RSD为0.33%，测得甘草酸铵RSD为0.24%，结果符合要求。

2.6 重现性试验取同一批号(20130510)样品“装量差异”项下的内容物，研细，取约1 g，精密称定，共取6份，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，按“2.1”项下色谱条件分析，测定每份样品中绿原酸和甘草酸铵含量。结果样品中绿原酸平均含量为0.699 mg，RSD为1.6%;甘草酸铵平均含量为0.383 mg/g，RSD为1.8%，结果均符合要求。

图1 对照品(A)供试品(B)阴性对照(C)混合对照品(D)HPLC色谱图

2.7 稳定性试验取同一批号(20130510)样品装量差异项下的内容物，研细，取约1 g，精密称定，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，按“2.1”项下色谱条件分析，分别在0、2、4、6、8和10 h，测定样品中绿原酸和甘草酸铵峰面积，测得峰面积值的RSD分别为0.27%和0.22%，说明样品溶液在10 h内稳定，符合试验要求。

2.8 回收率试验取绿原酸对照品和甘草酸铵对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为约含绿原酸0.15 mg/ml、甘草酸铵0.1 mg/ml的混合对照品溶液;另取不含金银花与甘草的阴性样品，研细，取约1 g，共9份，精密称定，分别精密加入上述混合对照品溶液3.2、4.0和4.8 ml各3份，再加甲醇分别至25 ml，制得供回收率用供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，计算回收率，结果绿原酸平均回收率为100.3%，RSD为1.3%;甘草酸铵平均回收率100.5%，RSD为1.6%。符合试验要求。结果见表2。

表2 回收率试验测定结果

2.9 样品测定取3个批号的样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，按“2.1”项下色谱条件测定样品中绿原酸和甘草酸铵含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择选择流动相时，分别比较了甲醇－水和乙腈－水不同比例的流动相系统，并加入适量磷酸改善峰形，结果以乙腈－0.1%磷酸溶液进行梯度洗脱，各个组分可以与相邻杂质峰分离完全，峰形较好。

3.2 检测波长的选择经紫外光谱扫描，可以看到绿原酸在327 nm有最大吸收，甘草酸铵在254 nm有最大吸收，考虑到两种成分没有相近波长的最大吸收，故选用双波长进行检测。

3.3 提取方法和提取溶剂的考查试验中分别采取加热回流和超声处理的提取方法，测定结果基本相同，为试验操作方便简捷，故将超声提取定为本品提取方法。试验中还分别采取70%乙醇、甲醇、50%甲醇为提取溶剂，结果显示，提取溶剂使用单纯的甲醇提取，含量测定结果较高;而采用加有水的甲醇和乙醇，测定结果较低，故本试验提取溶剂定为甲醇。

1中国药典［S］.一部.2010:80，205

2薛士荣，李玉仿，孙燕燕.高效液相色谱法测定小儿清化丸中的绿原酸和芍药苷的含量［J］.天津药学，2011，23(5):9－11，16

3杨静，高文远.HPLC法测定乳疮丸中绿原酸的含量［J］.天津药学，2010，22(3):16－17

R927.2

A

1006－5687(2014)02－0017－03

2014－01－02