HPLC法测定阿莫西林有关物质的测量不确定度评价*

尹立平，李文月

(天津市宝坻区药品检验所，天津301800)

HPLC法测定阿莫西林有关物质的测量不确定度评价*

尹立平，李文月

(天津市宝坻区药品检验所，天津301800)

目的:对采用HPLC法测定阿莫西林有关物质的测量不确定度进行评定。方法:建立数学模型，分析不确定度来源，量化不确定度各分量，合成不确定度，计算扩展不确定度。结果:阿莫西林有关物质拓展不确定度U(Y单)=2× 5．76×10－5=1．15×10－4;U(Y总)=2×8．65×10－5=1．73×10－4。结论:拓展不确定度很小，阿莫西林有关物质结果可信度高。

阿莫西林，HPLC法，测量不确定度评定

测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，是与测量结果相关联的参数［1］，是评价测量水平的指标和判定测量结果质量的依据。测量不确定度越小，测量结果的质量越高。本文以HPLC法测定阿莫西林有关物质为例，引入测量不确定度，进行分析评估，为评价测量结果的准确性提供可信依据［2－6］。

1 实验

1.1 仪器与试药岛津LC－2010CHT高效液相色谱仪;梅特勒托利多天平AG 135;5 ml移液管，50和100 ml量瓶;阿莫西林对照品23.53 mg(中国药品生物制品检定所，批号130409－201011，含量:85.8%);阿莫西林胶囊(华北制药股份有限公司，批号J1301202，规格:0.25 g);乙腈为色谱纯;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件色谱柱:Agilent ZORBAX SB－C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相A:0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(取0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液，用2 mol/L氢氧化钾溶液调节pH至5.0)－乙腈(99∶1);流动相B:0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 5.0)－乙腈(80∶20);检测波长:254 nm;进样量:20 μl;先以流动相A－流动相B(92∶8)等度洗脱，待阿莫西林峰洗脱完毕后立即按表1进行线性梯度洗脱。

表1 梯度洗脱系统

1.3 测定方法精密称取阿莫西林胶囊内容物0.203 5 g置100 ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精取续滤液(2.0 mg/ml)20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图;另精密称取阿莫西林对照品23.53 mg，置100 ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 ml置50 ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀(20 μg/ml)，精密量取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图;供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照品溶液主峰面积的1.0%，各杂质峰面积的和不得大于对照品溶液主峰面积的5.0%。

2 测量不确定度评估

2.1 数学模型

X%单=(At单×Ws×P×Vt)/(As×Wt×Vs)× 100%

X%总=(At总×Ws×P×Vt)/(As×Wt×Vs)× 100%

式中:

X%单—供试品中阿莫西林单个杂质的百分含量

X%总—供试品中阿莫西林各杂质和的百分含量

At单—供试品单个杂质峰面积

At总—供试品中各杂质峰面积和

As—对照品中阿莫西林的峰面积

Wt(s)—供试品(对照品)的称样量

Vt(s)—供试品(对照品)溶液的稀释倍数

P—阿莫西林对照品的含量

2.2 测量不确定度的来源HPLC法测定阿莫西林有关物质的不确定度来源主要有以下几个方面:对照品称重的相对标准不确定度U(Ws);对照品溶液稀释玻璃量器引入的相对标准不确定度U(Vs);对照品峰面积引入的相对标准不确定度U(As);供试品称重的相对标准不确定度U(Wt);溶液稀释玻璃量器引入的相对标准不确定度U(Vt);供试品峰面积引入的相对标准不确定度U(At)。

2.3 不确定度各分量的量化

2.3.1 对照品称重的相对标准不确定度U(Ws)

2.3.1.1 天平精度属于B类不确定度。根据检定证书天平精度d=0.01 mg，按矩形分布(k=31/2)计算，则标准不确定度U(Ws1)=0.01/31/2=5.77× 10－3。

2.3.1.2 称量的重复性属于A类不确定度。取对照品约23.5 mg，重复测定10次，结果为:23.60、23.56、23.49、23.50、23.52、23.54、23.49、23.57、23.53和23.50 mg。标准偏差S=0．04，则标准不确定度U(Ws2)=S/n1/2=0.04/101/2=1.26×10－2。

2.3.1.3 线性属于B类不确定度。天平供应商提供的线性为0.03 mg，按矩形分布(k=31/2)计算，则标准不确定度U(Ws3)=0．03∕31/2=1．73×10－2。减重称量都是由相对独立的2次称量所得，故对照品称重的相对标准不确定度U(Ws)=2×［U2(Ws1)+U2(Ws2)+U2(Ws3)］1/2/23．53=1．88×10－3。

2.3.2 对照品溶液稀释过程玻璃量器引入的相对标准不确定度U(Vs)在对照品溶液逐级稀释过程中，使用到了100 ml、50 ml量瓶和5 ml移液管，经检定为A级。有三方面因素。

2.3.2.1 玻璃量器校准属于B类不确定度。容量允差:100 ml量瓶为±0.10 ml，50 ml量瓶为±0.05 ml，5 ml移液管为±0.015 ml，按矩形分布(k=31/2)，U (Vs1)={［0.1/(31/2×100)］2+［0.05/ (31/2×50)］2+［0.015/(31/2×5)］2}1/2=1.91× 10－3。

2.3.2.2 温度玻璃量器校准温度为20℃，实验时温度相差5℃，水的膨胀系数为2.1×10－4/℃，按矩形分布(k=31/2)，U(Vs2)={［(5×2.1×10－4×100)/ (31/2×100)］2+［(5×2.1×10－4×50)∕(31/2× 50)］2+［(5×2.1×10－4×5)∕(31/2×5)］2}1/2= 1.05×10－3

2.3.2.3 重复性属于A类不确定度。在20℃室温下，水的密度为1.002 85 g/ml，采用减重法，通过称量水的重量测定量瓶及移液管的体积，重复5次测量得到数据如表1所示。

U(Vs3)={［(0．015∕(51/2×100)］2+［(0．005 3∕(51/2×50)2］+［(0．001 3∕(51/2× 5)2］}1/2=1．42×10－4。

U(Vs)=［U2(Vs1)+U2(Vs2)+U2(Vs3)］1/2= 2．18×10－3。

表1 _减重法测定量瓶及移液管的体积

2.3.3 对照品溶液色谱峰面积的相对标准不确定度U(As)来源有2个:①进样重复性:属于A类不确定度。取同一对照品溶液，连续进样5次峰面积为: 68 752、68 799、68 819、68 909和68 882，计算峰面积的平均值为68 832，标准偏差S=63．42。U(As1)= (S/n1/2)/平均值=4.12×10－4。②系统影响:由于供试品溶液和对照品溶液是在相同条件下测定，故产生的系统偏差可被抵消。即U(As)=4.12×10－4。

2.3.4 供试品的称量相对标准不确定度U(Wt)

2.3.4.1 天平精度属于B类测量不确定度。根据检定证书可知天平精度d=0.1 mg，按矩形分布(k= 31/2)计算，则标准不确定度U(Wt1)=0.1/31/2= 5.77×10－2。

2.3.4.2 重复性属于A类测量不确定度。取供试品约0.200 g，重复测定10次，结果为:0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5和0.203 5 g。标准偏差S=0，则标准不确定度U(Wt2)=S/n1/2=0/101/2=0。

2.3.4.3 线性属于B类测量不确定度。根据检定证书所用天平示值误差为0.2 mg，按矩形分布(k= 31/2)计算，则标准不确定度U(Wt3)=0．2∕31/2= 1．15×10－1。供试品称重也是减重称量为0.203 5 g，故供试品称重的相对标准不确定度U(Wt)={2×［U2(Wt1)+U2(Wt2)+U2(Wt3)］1/2∕0．203 5×103= 0．016 5/0．203 5×103=1．26×10－3。

2.3.5 供试品溶液稀释过程玻璃量器引入的相对标准不确定度U(Vt)测量不确定度分析同“2.3.3”项。供试品溶液稀释过程中只用到100 ml量瓶，U (Vt)={［0.1∕(31/2×100)］2+［(5×2.1×10－4× 100)∕31/2×100)］2+［0.015∕(51/2×100)］2}1/2= 8.40×10－4。

2.3.6 供试品溶液色谱峰面积的相对标准不确定度U(At)供试品溶液重复进样2次，按极差法计算(取n=2时，极差系数C=1．13，极差R1=最大峰面积－最小峰面积)，S=(R1/C)，U(At)=(S/n1/2)/平均值。①供试品溶液色谱图中记录最大杂质色谱峰面积为33 622、32 369，平均值为32 995。R1=1 253，S= 1 108．85，U(At单)=2.38×10－2;②供试品溶液色谱图中各杂质峰面积和为:184 887、183 220，平均值为184 053。R2=1 667，S=1 475．22，U(At总)= (S/n1/2)/平均值=5．67×10－3。

2.4 合成相对标准不确定度Uc(Y)合成标准不确定度U单=［U2(P)+U2(Ws)+U2(Vs)+ U2(As)+U2(Wt)+U2(Vt)+U2(At单)］1/2=［(1.88×10－3)2+(2.18×10－3)2+(4.12× 10－4)2+(1.26×10－3)2+(8.40×10－4)2+(2.38× 10－2)2］1/2=2.40×10－2;

合成标准不确定度U总=［U2(P)+U2(Ws)+ U2(Vs)+U2(As)+U2(Wt)+U2(Vt)+ U2(At总)］1/2=［(1.88×10－3)2+(2.18×10－3)2+ (4.12×10－4)2+(1.26×10－3)2+(8.40×10－3)2+ (5.67×10－3)2］1/2=6.55×10－3。

Y单=［(32 995×23．53×10－3×85．8%×50)/ (68 832×0．203 5×100×50/5)］×100%=0．24%;

Y总=［(184 053×23．53×10－3×85．8%×50)/ (68 832×0．203 5×100×50/5)］×100%=1．32%。

合成相对标准不确定度Uc(Y单)=0．24%× 2．40×10－2=5．76×10－5;

合成相对标准不确定度Uc(Y总)=1．32%× 6．55×10－3=8．65×10－5。

2.5 扩展不确定度U(Y)U(Y)=K×UC(Y)，Y的可能值作正态分布估计，本实验取包含因子K=2(置信概率为95%)，扩展不确定U(Y单)=2×5．76× 10－5=1．15×10－4;U(Y总)=2×8．65×10－5=1．73× 10－4。

2．6测量不确定度报告测量不确定度用Y±U(Y)表示，即X%单=0．24%±1．15×10－4(k=2);X%总= 1．32%±1．73×10－4(k=2)。

3 讨论

阿莫西林的有关物质测定采用单点外标法，环境温度、湿度对质量会带来影响，其不确定度已纳入称量重复性中;对照品溶液进行测定时，在进样、分离、检测过程中，产生的随机影响包括进样体积重复性、泵流速稳定性、分离重复性、检测器稳定性、积分变动性等，以上这些影响可合并为进样重复性引入的不确定度。各项因素带来的不确定度较小，说明本所检验室环境、检验仪器、检验人员操作等因素质控较好，阿莫西林有关物质含量结果可信度较高。

1国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示［S］.JJFl059.1－2012

2中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南［S］.CNAS－GL06.

3中国药典［S］.二部.2010:402

4全国法制计量技术委员会.化学分析测量不确定度评定［S］. JJFl135－2005

5周燕，金佩芬，薛磊冰.HPLC法测定双黄连胶囊中黄芩苷含量不确定度评定［J］.中国药师，2011，14(2):221－223

6岑志芳，高卫东.HPLC法测定健胃消食片中橙皮苷含量的测量不确定度分析［J］.中国药房，2010，21(19):1786

R927.11

A

1006－5687(2014)02－0024－03

2013－12－04