亚低温干预下新生大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织Bax基因表达变化及意义1）

李迎敏，阴怀清，栗 红，张 巍，张晓佳，冯钰淑，张 新

新生儿缺氧缺血性脑损伤（HIBD）所致神经元损伤主要有坏死和凋亡两种方式。缺氧诱导因子1（HIF－1）、Bcl－2、Bax等分子共同参与和调节由缺氧引起的凋亡。生理或病理缺氧状态下HIF－1对维持机体氧平衡有重要作用［1－3］，可通过作用于下游靶基因以减少Bax［4］等促凋亡因子。近年来的实验研究表明亚低温干预是治疗HIBD 最具有前途的措施之一［5－8］。亚低温干预可抑制并减少HIBD 所引起的神经元凋亡［9，10］，对HIBD起到重要脑保护作用。

1 材料与方法

1.1 模型制作 新生7日龄Sprague－Dawley清洁级大鼠120只，由山西医科大学动物实验中心提供，雌雄不拘，体重10g～15g。HIBD 模型制备参照Rice［11］方法，大鼠采用乙醚麻醉后，分离出左颈总动脉并永久结扎，假手术动物仅分离出左侧颈总动脉，不予结扎，术后回笼恢复2h，再将鼠放入37℃水浴箱内的低氧箱中，箱底铺钠石灰以吸收二氧化碳，通入8%氧气和92%氮气的混合气，于出气孔检测氧浓度（Y－12C 型数字测氧仪，上海康华生化仪器制造有限公司），2h后开盖，在箱内与空气接触并恢复15min。

1.2 亚低温实施及实验分组 实验动物采用完全随机设计分为3组：假手术组（A 组，肛温37℃，n＝40）假手术动物，缺氧缺血组（B组，肛温37 ℃，n＝40），模型制备完成后笼内母乳喂养，亚低温干预组（C组，肛温33 ℃，n＝40），模型制备完毕将动物放入半导体可调恒温水浴箱（温控范围10 ℃～50 ℃上海理工大学制冷工程研究所研制）的暖箱内（34℃），维持至亚低温结束，期间采用配方奶粉喂养［12］。其中各组又根据处死动物的时间（HIBD 后2h，6h，12h，24h，48h，）随机分为5个亚组，每个亚组8只。

1.3 行为及脑组织标本外观观察 实验动物置于缺氧环境中肉眼观察有无异常行为改变；采用断头法处死动物后，观察缺血侧与对侧脑组织外观形态的改变。

1.4 Bax mRNA 表达的测定 取缺血侧脑组织，按Trizol试剂说明提取脑组织总RNA；采用逆转录试剂盒合成cDNA；以cDNA 为模板，采用Real－time基因扩增仪（西安天隆科技有限公司）进行PCR 扩 增，内 参β－actin上 游 引 物5′－gtc agg tca tca cta tcg gca at－3′，下游引物5′－agaggt ctt tac gga tgt caa cgt－3′；Bax上游引物5′－tgc agagga tga ttg ctg ac－3′，下游引物5′－gat cag ctc ggg cac ttt ag－3′（两者均由上海生物工程技术有限公司合成）。RT－PCR操作按试剂盒说明进行。PCR 反应条件：94℃预变性10min，活化Tag酶；94 ℃变性15s，60 ℃退火60s，72 ℃延伸30s，45个循环结束；PCR 产物以荧光TaqMan的方法检测。计算2－ΔΔCT［13］值反映目的基因表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析，计量数据以均数±标准差表示。根据正态性及方差齐性检验结果，多组间比较采用完全随机设计因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验，检验水准a＝0.05。

2 结 果

2.1 行为观察 实验前新生大鼠无行为异常的表现。置于缺氧环境中的新生大鼠，全部发生不同程度的异常行为改变，主要表现为：前期出现烦躁、多动、呼吸加深加快、全身紫绀，中期站立不稳、全身不断抖动、有时会出现夹尾左旋，后期烦躁消失，活动减少明显，出现淡漠、激惹，部分可能出现惊厥。假手术组行为能力正常。

2.2 脑组织标本外观 假手术组新生大鼠脑标本外观正常，左右对称；缺氧缺血组脑组织：2h肉眼观无明显改变，6h、12h缺血侧标本出现轻微的脑含水量增多，24h～48h出现明显的脑含水量增多，大小不等，缺血侧脑组织变小、萎缩；亚低温组双侧脑组织大小基本正常，无明显水肿、萎缩。

2.3 各组脑组织Bax mRNA 表达的比较（见表1）

表1 各组脑组织Bax mRNA 表达的比较（2－ΔΔCT）

3 讨 论

HIBD 发生以凋亡为主的迟发性神经元死亡。一般认为，凋亡是一个需要能量的主动细胞死亡过程，具有阶段性和程序性，在一定的条件下可逆，因此在凋亡的可逆阶段抑制及减少缺氧缺血后神经元的过度凋亡，可作为脑损伤干预的重要措施之一。HIBD 诱发的细胞毒性物质作用于脑组织细胞，通过诱导前凋亡蛋白基因P53表达，使BH3－only蛋白通过间接激活模式［14，15］活化促凋亡分子Bax，Bax／Bcl－2的比例出现失衡，促凋亡分子Bax在线粒体膜上形成寡聚物，可促使线粒体通透性转换孔（PTP）开放，而PTP可作为线粒体的刺激感受器接受有关受体信号，包括膜间隙的腺嘌呤核苷酸信号和外膜的电位依赖性离子通道信号。PTP的开放会形成正反馈扩大过程，导致线粒体结构的破坏及其功能的紊乱，包括渗透压改变及失衡、线粒体外基质内流、细胞器发生肿胀，致使线粒体的内外膜依次裂解，释放出含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）蛋白激酶，进而激活caspase，凋亡信号的正反馈作用被级联放大，从而诱导细胞凋亡。

本实验证实经亚低温（32 ℃～34 ℃）干预的新生大鼠，缺血侧脑组织水肿程度较缺氧缺血组明显降低，且Bax mRNA 的表达在假手术组表达无明显变化；在缺氧缺血组2h即出现上升，12h达高峰，12h～48h维持在高峰；亚低温干预组各时间点Bax mRNA 的表达水平较缺氧缺血组明显降低：2h出现轻微上升，6h出现下降并达到最低水平，充分证实了亚低温干预可以减少缺血侧Bax mRNA 的表达，从而降低脑组织细胞的凋亡，延长损伤细胞存活时间，对HIBD 的脑组织具有确切的保护作用。然实验后期即HIBD 后12h～48h，Bax 基因的表达出现微升高，其可能作用机制为亚低温干预可上调HIF－1αmRNA 在脑组织的表达并延长其表达的时程［16］，而引起具有保护作用的基因表达［17－19］。HIF－1α与p53结合，使p53稳定并发挥促进细胞凋亡的效应，即诱导Bax mRNA 表达微上调，下调Bcl－2，Bax／Bcl－2的比例增加，促进细胞凋亡以清除不适应缺氧缺血的细胞。

Bax参与了新生大鼠HIBD，同时亚低温干预能明显降低脑组织Bax mRNA 表达，减少神经细胞的凋亡，清除不适应缺氧缺血的细胞，对HIBD 后的脑组织具有肯定的保护作用。

［1］ Goda N，Ryan HE，Khedive B，et al.Hypoxia－inducible factor－1alpha is essential for cell cycle arrest during hypoxia［J］.Mol Cell Biol，2003，23（1）：359－369.

［2］ Gregg L，Semenza.Hypoxia－inducible factor 1：Regulator of mitochondrial［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1813（7）：1263－1268.

［3］ Tomoharu T，Takuhiko W，Hiroki D，et al.Persisting mild hypothermia suppresses hypoxia－inducible factor－1 protein synthesis and hypoxia－inducible factor－1－mediated gene expression［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2010，298：R661－R671.

［4］ 张岚，邢达.JNK／Bim／Bax途径在TNF－α诱导分化PCI2细胞凋亡过程中的作用机制［J］.生物化学与生物物理进展，2010，37（4）：370－380.

［5］ Glickman PD，Wyatt JS，Azaparat D，et al.Selective head cooling mild systemic hypothermia after neonatal encephalopathy：Multicentre randomized trial［J］.Lancet，2005，365：663－670.

［6］ Shankaran S，Laptook AR，Ehrenkranz RA，et al.Whole－body hypothermia for neonates with hypoxic－ischemic encephalopathy［J］.N Engl J Med，2005，353：1574－1584.

［7］ 选择性头部亚低温治疗新生儿HIE多中心协作组.亚低温治疗新生儿缺氧缺血性脑病临床多中心研究阶段性疗效分析［J］.中国循证儿科杂志，2006，2（1）：99－105.

［8］ Zhang P，Cheng GQ.Research progress in mild hypothermia treatment of neonatal hypoxic－ischemic encephalopathy［J］.CJCP，2013，15（10）：918－922.

［9］ Kessel I，Waisman D，Barzilai M，et al.Hypothermia as a treatment for hypoxic ischemic encephalopathy after neonatal asphyxiaupdate［J］.Harefuah，2013，152（9）：539－542；563.

［10］ Buratti S，Lampugnani E，Tuo P，et al.Congenital diaphragmatic hernia repair during whole body hypothermia for neonatal hypoxic ischemic encephalopathy［J］.J Perinatology，2012，32（12）：981－984.

［11］ Rice JE，Vannucci RC，Brierley JB.The influence of immaturity on hypoxic－ischemic brain damage in the rat［J］.Ann Neurol，1981，9（2）：130－141.

［12］ 卢耀增.实验动物学［M］.北京：北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社，1995：189－190.

［13］ Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in real－time RT－PCR［J］.Nucl Acids Res，2001，29：2002－2007.

［14］ Uren RT，Dewson G，Chen L，et al.Mitochondrial permeabilization relies on BH3ligands engaging multiple prosurvival Bcl－2 relatives，Not Bak［J］.Cell Biol，2007，177（2）：277－287.

［15］ Willis SN，Fletcher JI，Kaufmann T，et al.Apoptosis initiated when BH3lignds engage multiple Bcl－2homologs，not Bax or Bak［J］.Science，2007，315（5813）：856－859.

［16］ 李伟，阴怀清，武师润，等.亚低温干预下新生大鼠缺氧缺血性脑病时HIF－1基因表达变化及意义［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2013，10（7）：847－848.

［17］ Mu D，Chang YS，Vexler ZS，et al.Hypoxia－inducible factor－1alpha and erythropoietin up regulation with deferoxamine salvage after neonatal stroke［J］.Exp Neurol，2005，195（2）：407－415.

［18］ Mu D，Jiang X，Shedon RA，et al.Regulation of hypoxia－inducible factor 1alpha and induction of vascular endothelial growth factor in a rat neonatal stroke model［J］.Neurobiol Dis，2003，14（3）：524－534.

［19］ 赵琛，谭斐.低氧诱导因子－1激活的调节［J］.生命科学，2013，25（1）：40－46.