原发性高血压颈动脉硬化与基质金属蛋白酶－3基因型的相关性分析

徐春华

原发性高血压病人导致血压上升的病因不明，该病是多种心脑血管疾病的诱因与危险因素［1］，基质金属蛋白酶（MMPS）能够将基底膜以及胞外基质的绝大部分蛋白质降解，而基质金属蛋白酶－3（MMP－3）被认为是与动脉硬化密切相关的基质金属蛋白酶，MMP－3基因的启动子－1171（6A／5A）的序列差异暗示高血压病人动脉硬化具有遗传易感性［2］。本文分析高血压病病人颈动脉硬化与MMP－3基因启动子多态性的相关性，为有效防治高血压病动脉粥样硬化提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本院2010年5月—2013年5月收治原发性高血压病人108例（观察组），男性62例，女性46例，年龄54岁～76岁（55.77岁±10.02岁）。全部病人根据2004年《中国高血压病诊断指南》进行诊断与分级，同时将肥胖者、关节疾病、痛风、免疫疾病、慢性炎症、近期心肌梗死、未控制的充血性心力衰竭、外周动脉疾病、中风伴肢体偏瘫、短暂性脑缺血发作、继发性高血压病以及肿瘤者予以排除。在我院同期进行健康体检的106例体检者作为对照组，男性63例，女性43例，年龄54岁～77岁（56.02岁±8.98岁）。两组均对临床生化指标以及血液MMP－3基因型进行检测，观察组高血压者69例与对照组体检者31例采取颈动脉超声检查。

1.2 检测方法

1.2.1 超声检查 应用西门子SONOLINE G60S彩色多普勒超声诊断仪进行检查，选择探头频率（5.0～7.5）MHz。从颈总动脉起始后纵向分别对颈总动脉、分叉处、颈内外动脉进行探查，至颈动脉最高处后旋转探头90°角，顺血管走行横向进行扫查，对斑块及其位置、大小以及是否有颈动脉内－中膜厚度（IMT）增厚等状况进行观察记录。

1.2.2 超声检查指标 颈动脉内－中膜厚度：在舒张末期的双侧颈总动脉起始处、分叉前10 mm 处以及膨大处进行分别测量；颈动脉粥样斑块：局部呈凸起且增厚，向管腔内突起的厚度＞1.2mm，对斑块发生处进行定位。

1.2.3 临床检查指标 测定受检者身高、体重、血压等，计算体重指数。空腹抽取3mL晨静脉血，对胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C）以及三酰甘油（TG）检测。

1.2.4 检测MMP－3基因多态性 抽提受检者血液DNA，设计 一 对 正 义 引 物 5′－GTTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAG－3′以及反义引物5′－TTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCAC－3′进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。对扩增后得到的PCR 产物进行PsyⅠ酶切，获得约127bp长的片段，酶切产物经电泳后，结果显示MMP－3 基因启动子－1171位点具有明显的多态性，不同受检者分别出现1、2、3 条泳带，对应三类基因型，将其命名为6A／6A、5A／5A 以及5A／6A，片段长度127bp（6A／6A）和127bp、95bp、30bp（5A／6A），95bp、30bp。通过公式：1／2（纯合子×2＋杂合子）／受检者例数来计算等位基因频率。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示。受检者基因型与Hardy－Weinberg平衡的符合度、等位基因频率以及组间基因型对比采用四格表χ2检验；对所得计数数据采用率表示，并采取χ2检验。对颈总动脉相关参数的影响因素进行多元逐步回归分析，针对两因素之间的相关性进行Pearson 相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组基因型及等位基因频率分布状况 观察组与对照组受检者的基因型分布均与Hardy－Weinberg平衡一致。观察组6A／6A 基因型（65.7%）与6A 等位基因频率（82.4%）高于对照组基因型（53.8%）与等位基因频率（75.9%），但分布差异相比不具有统计学意义（基因型P ＝0.092，等位基因P ＝0.118）；男女性别相比无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 观察组与对照组基因型及等位基因频率分布状况分析

2.2 两组基因型及颈动脉IMT 之间的相关性 与对照组相比，观察组5A／5A＋5A／6A 基因型病人在起始部位、膨大前以及膨大部位的IMT均出现增厚，两组差异相比不显著（P ＞0.05）；观察组6A／6A 基因型病人在起始部位、膨大前以及膨大部位的IMT 均显著高于对照组（P＜0.05）。详见表2。

表2 不同基因型颈动脉IMT 指标对比

表2 不同基因型颈动脉IMT 指标对比

与对照组相比，1）P＜0.05。

基因型 起始 部 位 5A／膨5大A＋前51A0／6mAm（ m处m ） 膨大部位 起始部位 膨6A大／6前A1（0mmmm） 处 膨大部位观察组 0.80±0.19 0.84±0.18 1.16±0.21 1.07±0.181） 0.99±0.191） 1.29±0.181）对照组 0.71±0.18 0.64±0.18 0.95±0.20 0.77±0.16 0.70±0.20 0.99±0.18

观察组不同基因型颈总动脉内径与IMT 对比分析，观察组6A／6A 基因型病人颈总动脉分叉前部位的IMT 高于5A／5A＋5A／6A 基因型病人（P＜0.05）；但两基因型在颈总动脉内径方面相比不具有统计学意义。详见表3。

表3 观察组不同基因型颈总动脉内径与IMT 对比

表3 观察组不同基因型颈总动脉内径与IMT 对比

同5A／5A＋5A／6A 基因型相比，1）P＜0.05。

基因型 分叉前处IMT（mm） 颈总动脉内径（mm）5A／5A＋5A／6A（16） 0.84±0.18 7.05±0.81 6A／6A（54） 0.99±0.191） 7.21±0.79

2.3 心血管病危险因素

2.3.1 心血管病一般危险因素与IMT 的相关性 简单相关性：病人年龄、脉压、舒张压、收缩压以及体重指数与IMT 的Pearson 相关系数（r）依次为0.661，0.392，0.039，0.409，－0.334（P＜0.05）；偏相关：在限制年龄后，病人的脉压、舒张压、收缩压以及体重指数与IMT 的Pearson 相关系数（r）依次为0.114，0.188，0.225，－0.304（P＜0.05）。

2.3.2 观察组颈总动脉IMT 与内径影响因素的逐步回归结果将观察组颈总动脉IMT 与内径（D）均作为应变量（Y），将危险因素 年龄（Xa）、脉压（Xb）、收缩压（Xc）、舒张压（Xd）、体重指数（Xe）、基因型（Xf）、三酰甘油（Xg）以及低密度脂蛋白胆固醇（Xh）作为自变量进行逐步回归分析。结果表明：病人年龄与舒张压是颈总动脉内径的关键影响因素（回归系数依次为0.05，0.027，P＜0.05，YD＝1.594＋0.05Xa＋0.027Xc）；病人年龄、舒张压、体重指数是IMT 的关键影响因素（回归系数依次为0.010，0.008，－0.005，P＜0.05，YIMT＝－0.221＋0.010Xa＋0.008Xc－0.005Xe）。

3 讨 论

同时对健康人群与心血管病高危人群开展的心血管病研究以及流行病学研究均提示，颈动脉内－中膜厚度指标与大部分传统的心血管病的危险因素之间具有一定的相关性，而且对健康人群开展的研究显示，年龄与内－中膜厚度之间呈现出线性相关，高龄人群发生普遍的IMT 增厚者并未全部检出斑块形成，故而提出IMT 增厚在某种意义上来说是机体老化过程中所伴发的生理反应［3］。高血压病患者所处的分级越高、脉压越大，其颈动脉内径就越大，IMT 厚度增加以及斑块的检出率就越高［4］。使用脉压来预测心血管事件的危险程度较应用收缩压与舒张压更加灵敏，脉压是心脑血管疾病发病与致死的独立危险因子，脉压升高与心血管病病人的死亡率密切相关［5］。本研究简单相关分析结果表明，受检者的年龄与IMT 之间具有最密切的相关性，病人年龄、脉压、收缩压以及体重指数与颈总动脉内－中膜厚度均有密切的相关性，但在限制年龄后的偏相关分析显示，病人的脉压、收缩压以及体重指数与内－中膜厚度的相关性均出现降低，差异比较不具有统计学意义。

基质金属蛋白酶属于内切蛋白水解酶家族成员之一，其发挥作用需有锌离子存在，该酶能够降解基底膜及胞外基质部位的绝大部分蛋白质［6］。MMP－3作为基质金属蛋白酶家族成员之一，其具有广泛的特异性底物，包括胶原、蛋白聚糖、层连蛋白、纤连蛋白以及明胶等，除可以将上述底物降解以外，处于活性状态的MMP－3还能够将其他酶原激活，进一步产生一个正反馈环，故而MMP－3 在MMPS 家族激活途径中具有重要作用；MMP－3在斑块降解、纤维沉积及钙化过程中发挥作用，其启动子具有多态性，包括高活性5A／5A、中间活性5A／6A 以及低转录活性6A／6A。6A／6A 基因型者与颈动脉IMT 较厚具有密切的相关性，6A／6A 基因型的男性IMT 较其他基因型者厚15%左右，而且6A／6A 基因型的健康男性其IMT 也较其他健康基因型要厚［7］。

孙晓明等［8］对颈内动脉狭窄病人的研究表明，对照组6A纯合子的基因型频率与6A 等位基因频率显著低于观察组，这与本研究结果相符。本研究中6A／6A 基因型者颈动脉IMT 出现增厚，且内径增大；6A／6A 基因型者较6A／5A 基因型者斑块多。6A／6A 基因型者在其动脉壁中存在少量的有活性的基质细胞溶解酶，推测这是由其低水平的基因转录而引发的微弱蛋白水解活动，这将加快细胞外基质的沉积速度，最终使动脉硬化斑块进一步产生并发展。MMP－3能够参与动脉粥样硬化的发展过程，MMP－3低表达基因型个体的重塑以及降解基质的能力低下，造成动脉壁内中膜快速增厚并形成斑块。6A 等位基因是造成颈内动脉狭窄的一个独立性危险因子。本结果显示，病人年龄、体重指数以及舒张压是颈动脉内－中膜厚度的独立性危险因素，而基因型则没有进入逐步回归方程，推测这可能是由于本样本偏少造成的。此外，在对136例糖尿病病人以及101例健康男性受检者的研究中，健康男性的6A／6A 基因型者其颈动脉内径宽，且其IMT 出现增厚，而糖尿病组病人的三个基因型之间相比不具有统计学意义［9］。

由于检测技术、仪器设备等诸多因素影响，本项研究尚存在一定的不足，目前认为动脉粥样硬化是由多基因控制的疾病，基因多态性与基因表达之间具有密切的相关性，单个基因的效应常常被遮盖住，难以显现出来，故而应依据其病理生理的变化情况，研究多个候选基因，从整体上、多角度进行分析，而且选取的样本量应大，注意要有充分的代表性，明确各个基因多态性的效应，进而实施有针对性的方法来调控MMPS的表达情况，最终实现治疗的目的。

［1］ Romero AM，Mastromatteo－Alberga P，Escalona L，et al.MMP－3 and MMP－8levels in patients with chronic periodontitis before and after nonsurgical periodontal therapy［J］.Invest Clin，2013，54（2）：138－148.

［2］ Avdeeva AS，Aleksandrova EN，Novikov AA，et al.Relationship of the clinical efficiency of tocilizumab therapy to the serum level of matrix metalloproteinase－3in patients with rheumatoid arthritis［J］.Ter Arkh，2013，85（5）：24－29.

［3］ Loo WT，Wang M，Jin LJ，et al.Association of matrix metalloproteinase（MMP－1，MMP－3and MMP－9）and cyclooxygenase－2gene polymorphisms and their proteins with chronic periodontitis［J］.Arch Oral Biol，2011，56（10）：1081－1090.

［4］ Magarinos NJ，Bryant KJ，Fosang AJ，et al.Mast cell－restricted，tetramer－forming tryptases induce aggrecanolysis in articular cartilage by activating matrix metalloproteinase－3and－13zymogens［J］.J Immunol，2013，191（3）：1404－1412.

［5］ Turturro S，Sunoqrot S，Ying H，et al.Sustained release of matrix metalloproteinase－3to trabecular meshwork cells using biodegradable PLGA microparticles［J］.Mol Pharm，2013，10（8）：3023－32.

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［7］ Gnasso A，Motti C，Irace C，et al.Genetic variation in human stromelysin gene promoter and common carotid geometry in healthy male subjects［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000，20（6）：1600－1605.

［8］ 孙晓明，宋玉强，赵仁亮，等.基质金属蛋白酶－3基因多态性与颈动脉狭窄的相关性［J］.中国卒中杂志，2010，5（6）：449－453.

［9］ Irace C，Cortese C，Migale M，et al.Stromelysin gene promoter polymorphism and common carotid geomerry in diabetic subjects［J］.Int Angiol，2008，27（5）：413－418.