熊胆粉在麝香通心滴丸抗动脉粥样硬化中的作用研究1）

贾成林，熊敏琪，崔金刚，王培伟，沈 融，朱玉陵，王文健，陈 瑜，张 腾

动脉粥样硬化（AS）是一种血管慢性炎症病变，已经成为诱发心血管疾病的重要因素，严重影响着人类健康。据调查，我国心血管疾病患病率男性为1.78%，女性为1.10%，且患病率随年龄升高而增加。据估计，全国心血管疾病患者约有2.3亿人，每100个成年人中有20人患心血管疾病。全国每年因其死亡人数约350万人，每天因心血管病死亡9 590人，估计每分钟就有6人死于心血管疾病［1］。因此对动脉粥样硬化的防治已成为当今社会的首要任务。

麝香通心滴丸源于古方，有悠久的临床应用基础，具有芳香益气通脉、活血化瘀止痛，清热解毒等功效，在Ⅲ期临床观察治疗冠心病的研究中获得了良好的疗效。与冠心苏合香丸等其他临床用于冠心病治疗的中成药比较，最大的特点为“凉开法”，而动脉粥样硬化发生发展过程中，痰热瘀结是其重要的病理产物和致病因素，熊胆粉作为麝香通心滴丸的主要成分，味苦，性寒，具有清心、清热、化瘀之功，可能是其“凉开”特点的代表，近代药理学研究也提示，熊胆具有清热解毒、抑菌抗炎等作用。因此，本研究采用特异性基因敲除小鼠结合高脂饮食复制动脉粥样硬化动物模型，探究熊胆粉在麝香通心滴丸抗动脉粥样样硬化中的作用，为其凉开法治疗特点及临床推广应用提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 动物 以C57BL／6J小鼠为背景的ApoE－／－小鼠30只，体重（22.95±0.14）g，C57BL／6J小鼠9只，体重（24.10±0.28）g，均为雄性，8周龄，SPF 级，北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 药物及试剂 麝香通心滴丸全方药用浸膏、去熊胆粉浸膏、熊胆粉，均由内蒙古康恩贝药业有限公司圣龙分公司提供。实验前，所有药物均溶于生理盐水，终浓度：麝香通心滴丸全方浓度30mg／kg，拆方（为麝香通心滴丸去熊胆粉）30 mg／kg，熊胆粉浓度0.33mg／kg。血脂检测试剂盒购自南京建成科技有限公司。

1.3 仪器设备 冰冻切片机（型号：CM3050s，Leica）；正置显微镜（型号：DM2000，Leica）；高速冷冻离心机（Sigma）；微量台式离心机（Eppendorf）；Image－Pro Plus 6.0专业图像分析系统（Media Cybernetics）

1.4 动物分组及给药 所有实验动物普通饲料适应性喂养1周后，ApoE－／－小鼠随机分为4组，分别为复方组、拆方组、熊胆粉组（每组7只）及模型组（9只），均给予高脂饮食（含有20%脂肪，其中1.5%为胆固醇）。C57小鼠设为正常组，9只，普通饮食喂养。治疗组分别给予麝香通心滴丸水溶液0.2mL、拆方水溶液0.2mL、熊胆粉水溶液0.2mL；模型组及正常组给予等体积生理盐水。各组均为灌胃给药，每天定点给药1次，连续8周。

1.5 动物处理及病理形态学观察 连续给药8 周后，停止给药，末次给药后次日，各组小鼠眶周静脉丛采血后处死，并分离主动脉，将主动脉弓垂直向上，OCT包埋，干冰速冻后，再转入－80度冰箱，然后制成10μm 切片，行HE 染色、油红O 染色及Masson’s Trichrome染色来观察病理形态学的改变，用Image－Pro Plus软件进行定量分析。

1.6 血清血脂水平检测 外周血中总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（HDL）和高密度脂蛋白（LDL）均用生化法检测，步骤严格按照试剂盒要求操作。

1.7 统计学处理 采用SPSS18.0 统计软件分析。数据以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组ApoE－／－小鼠主动脉病理结果

2.1.1 HE染色 正常组小鼠主动脉内膜上几乎没有斑块形成，模型组与之相比斑块显著增多（P＜0.01）；3个给药组与模型组对比，斑块均有不同程度的减小，经过量化后的斑块相对面积，复方组与模型组比较（P＝0.043），拆方组与模型组比较（P＝0.049），熊胆粉组与模型组比较（P＝0.035），均有统计学意义，以熊胆粉组作用最明显。

2.1.2 油红O 染色 油红O 能特异地结合脂质形成可见的红色，从而初步判定损伤范围。与正常组对比，模型组的损伤面积显著增加（P＜0.01）；与模型组对比，3个给药组的损伤面积均显著减小（P＜0.01）。量化后复方组和熊胆粉组的效果均很明显，去掉熊胆粉后的拆方组效果比其余两组弱。

2.1.3 Masson’s Trichrome染色 Masson’sTrichrome染色可以用来判定斑块纤维化的程度。与正常组相比，模型组纤维化 程 度 显 著 增 强（P ＜0.01）；与 模 型 组 相 比，复 方 组（P ＝0.0046）、拆方组（P＝0.0175）和熊胆粉组（P＝0.0152）的纤维化面积均有明显的减少。

2.2 熊胆粉对ApoE－／－小鼠的血脂水平的影响（见表1） 与正常组相比，模型组小鼠血清TC、TG和LDL水平显著升高（P＜0.01）；HDL水平显著降低（P＜0.01）；与模型组对比，复方组、拆方组和熊胆粉组小鼠血清TC、TG 和LDL 水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；HDL水平显著升高（P＜0.01）。

表1 熊胆粉对ApoE－／－小鼠血脂水平的影响 mmol／L

表1 熊胆粉对ApoE－／－小鼠血脂水平的影响 mmol／L

与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

组别 n TC TG LDL HDL正常组 9 6.46±0.55 0.84±0.05 4.14±0.24 0.84±0.02模型组 9 15.87±0.391）2.82±0.081）10.22±0.361） 0.41±0.021）复方组 7 10.76±0.483）2.09±0.163） 7.28±0.333） 0.65±0.053）拆方组 7 11.54±0.883）2.09±0.133） 8.78±0.561）2）0.56±0.023）熊胆粉组7 11.66±0.953）2.13±0.123） 7.93±0.473） 0.57±0.033）

3 讨 论

ApoE是血浆脂蛋白中重要的成分，在调节血浆胆固醇水平中起重要的作用，是高脂血症、动脉粥样硬化等发生、发展的一个重要分子靶标。ApoE 敲除小鼠能再现与人类ApoE 缺陷相似的特征，在给予高脂饮食后能自发的形成动脉粥样硬化［2］。选用ApoE－／－小鼠作为模型进行实验。本实验采用ApoE－／－小鼠加高脂饮食造模，用药物干预8周后，观察到熊胆粉能够减少动脉粥样硬化斑块损伤面积，降低ApoE－／－小鼠血脂水平，在全方抗动脉粥样硬化效应中起到了重要作用。

麝香通心滴丸是依据古方“至宝丹”“六神丸”化裁而来，主要由麝香、人参茎叶总皂苷、丹参、熊胆粉等药物组成。熊胆，作为中国四大动物药材之首（熊胆、麝香、虎骨、牛黄）之首，素有“药中黄金”之美誉。熊胆入药已有一千三百多年的历史，始载于中国唐朝苏敬的《新修本草》，明朝李时珍的《本草纲目》记载，熊胆味苦、性寒，归肝胆心经，无毒，具有清心、解热、利胆、明目等功效。近代药理学研究证实，熊胆具有清热解毒、抑菌抗炎、保肝护肝、利胆溶石、降脂降压等作用［3，4］。

致动脉粥样硬化的重要原因之一就是血脂水平异常，在长期高脂血症的情况下，氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）和胆固醇最容易对动脉内膜产生功能性损伤，使内皮细胞和白细胞表面的特性发生改变［5］，而且研究发现主要是低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）水平与AS的发生呈正相关，其机制是LDL 可以通过apoB100与细胞外基质相互作用沉积在动脉内膜下形成粥样硬化斑块［6］。相反，在流行病学研究中，发现血浆HDL 水平与动脉粥样样硬化性心血管疾病的风险成反比关系［7］。而且，有研究发现，HDL能促进巨噬细胞中胆固醇的外流［8］，这能降低巨噬细胞源泡沫细胞的形成。因此升高血浆中HDL 水平，降低LDL会对AS的发展起到一定的抑制作用。本研究发现麝香通心滴丸具有显著的降低血清中TC、LDL 及TG 含量，升高HDL水平的作用。去除了熊胆粉的拆方组虽然也有降脂作用，但作用明显不及全方，特别是去掉熊胆粉后降低LDL 的作用显著下降，实验数据提示，熊胆粉在协助麝香通心滴丸调节血脂的过程中发挥了重要作用。

本研究采用ApoE－／－小鼠，观察熊胆粉、复方、拆方对粥样斑块病理损伤的干预，以及调节血脂水平的作用，提示在麝香通心滴丸抗动脉粥样硬化的过程中，熊胆粉发挥了重要作用，是其凉开的关键组分，有关其凉开的具体作用机制有待进一步研究阐明。

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