急性肺损伤病人循环内皮祖细胞SDF－1α及其CXCR4受体表达研究1）

黄彦泽，郭伟新，王首红，覃铁和

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）病理改变是肺泡毛细血管膜急性弥漫性损伤，修复肺泡毛细血管膜是治疗的关键。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）参与血管内皮修复和新生，能整合至肺毛细血管，为修复肺泡－毛细血管膜提供基础［1］。最近研究发现，基质细胞衍生因子－1α（stromal cell derived factor 1alpha，SDF－1α）与CXCR4促进肿瘤细胞转移和肿瘤血管的新生［2，3］。本研究旨在观察急性肺损伤时EPCs的SDF－1α及CXCR4表达情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料 急性肺损伤组：为2012年1月—2013年3月我科收治的急性肺损伤病人12例，男7例，女5例；年龄50岁～70岁（58.6岁±10.4岁）。急性肺损伤诊断严格按照2006 年中华重症医学分会提出ALI／ARDS的诊断标准选取急性肺损伤病人。标准如下：有相应的原发病或诱因和危险因素；急性起病，出现呼吸困难或窘迫；氧合指数（PaO2／FiO2）＜300mmHg为ALI，PaO2／FiO2＜200mmHg为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）；正位X线片示双肺肺浸润性阴影；肺动脉楔压（PCWP）＜18mmHg，或无左心房压升高的临床证据。对照组：为年龄50岁～70岁的健康成人12名，男7名，女5名。两组均排除1年内脑梗死、心肌梗死病史，近期2周接受各种手术、肿瘤病人、糖尿病以及高血压病病人。所有入组受试者在进行实验抽血前均签署相关的知情同意书。

1.2 EPCs分离培养 诊断为急性肺损伤后24h内抽血分离单个核细胞，肝素抗凝取外周血10mL，密度梯度离心法获取单个核细胞，接种100mL培养瓶，M199培养基20mL（含20%胎牛血清）。血管内皮生长因子（VEGF）10ng／mL，上皮生长因子（EGF）10ng／mL，成纤维细胞生长因子（bFGF）2ng／mL，胰岛素样生长因子（IGF－1）2ng／mL诱导分化培养4d后用PBS洗去非贴壁细胞，换液培养至7d。

1.3 EPCs鉴定 按3×106／mL 接种于纤维连接蛋白包被的24孔板，细胞爬片培养第4天取出，以DiI－acLDL（2.4g／mL）37℃孵育1h，以检测EPC 摄取DiI－acLDL；用2%多聚甲醛固定细胞10min，PBS浸洗，将FITC－UEA－I（10g／mL）37 ℃孵育1 h，激光共聚焦显微镜鉴定UEA－I和DiI－acLDL 双染阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。

1.4 Western Blot检测SDF－1α、CXCR4蛋白表达水平 按照参考文献和本实验室已经建立的常规方法进行。SDF－1α、CRCX4等各种分子抗体购自Cell Signaling Technology公司。垂直电泳分离蛋白，对于小分子量蛋白采用Bio－RAD 半干转仪，而大分子蛋白采用湿转，将蛋白转至PVDF膜上，相应一抗4 ℃摇床孵育过夜，使用对应二抗孵育2h，PBS冲洗后ECL 化学发光法曝光感光底片，显影定影洗涤，扫描底片经过Band Scan图像分析软件半定量分析目的蛋白条带。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 共聚焦显微镜观察 EPCs 摄取荧光双染阳性×200。DiL－acLDL染色细胞呈红色；FITC－UEA－I染色细胞呈绿色；双染色细胞同时呈红、绿色。通过共聚焦显微镜鉴定，FITC－UEA－I和DiL－acLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。

2.2 SDF－1α、CXCR4蛋白表达（见表1、图1）

表1 两组SDF－1α、CXCR4蛋白表达

表1 两组SDF－1α、CXCR4蛋白表达

组别 n SDF－1αCXCR4对照组12 0.83±0.05 0.28±0.02病例组 12 0.31±0.02 0.15±0.01 P ＜0.05 ＜0.05

图1 组SDF－1α、CXCR4蛋白表达

3 讨 论

ALI是ICU 危重病病人最主要的病理生理表现之一，容易演变成ARDS。其主要的病理生理改变是肺泡－毛细血管膜的急性弥漫性损伤，受损的肺泡毛细血管屏障导致肺血管通透性增加、肺泡渗出增加、肺水肿以致于肺脏的通气／血流灌注比例失调，最终导致顽固性的低氧血症［1，2］。修复受损的血管内皮细胞最主要的手段之一。

肺泡－毛细血管膜再生和修复与EPCs有着密切关系。研究证实，EPCs能定向分化为内皮细胞和具有优先定位于血管和组织损伤处的特性，因而对受损部位的血管再生和内皮修复有着重要的作用［3］。最新的研究证明在油酸诱导的兔急性肺损伤模型，EPCs能定植至受损的肺血管，但不能大量定植［4］。Burnham 等［5］报道，急性肺损伤病人的生存率与其外周血EPCs的集落数呈显著正相关。这证明EPCs生物学功能的提高直接影响到疾病的预后，如何提高急性肺损伤病人循环EPCs的生物学功能已经成为治疗的关键。

最近发现基质细胞衍生因子－1α在血管新生中起着重要作用。已有研究证实EPCs能自分泌SDF－1α［6］。SDF－1α均能提高EPCs的动员、归巢及分化功能。SDF－1α 可与EPCs膜表面受体CXCR4 结合，诱导成熟或不成熟的祖细胞动员，并参与血管的生成［7］。在本研究中发现急性肺损伤组循环内皮祖细胞SDF－1α及CXCR4表达均有下降，可能是由于以下原因，一些研究已经表明，在严重的炎症阶段和炎性细胞因子的抑制SDF－1α的表达在体内和体外［8］。急性肺损伤是急性炎症导致肺血管内皮和上皮屏障的破坏，在这种生理和病理状态，SDF－1α、CXCR4的表达受到抑制。SDF－1α是一个强有力的趋化细胞表达CXCR4的CD34＋细胞，骨髓来源的间充质干细胞［9，10］。SDF－1α可以导致这些祖细胞归巢增加。如使用外源性SDF－1α能改善急性肺损伤内皮祖细胞，从而改善肺泡－毛细血管膜的急性弥漫性损伤。

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