醒脑静注射液对高血压脑梗死大鼠模型的神经保护作用1）

马 斌，刘 璐，张 扬，孙逸坤，赵一舟，高永红，辛喜艳，刘 剑

脑梗死是严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病，病人可遗留偏瘫、语言、认知、心理和情感障碍等［1］，深入研究其发病机制，积极寻找有效防治药物一直是人们研究的热点。研究表明，由于脑血流下降导致的脑缺血损伤会引起一系列病理反应包括兴奋性毒性、活性氧（ROS）产生过量、线粒体损伤、神经元凋亡。其中，产生过量的ROS被认为是脑缺血损伤过程中加重神经元损伤的重要因子［2］，且其逐渐被作为治疗脑梗死的新药物靶 标［3，4］。中药［5］及其复方 制 剂［6］在 缺 血 性 脑 血 管 病 治 疗 中的作用正逐渐受到重视。醒脑静注射液是根据安宫牛黄丸组方精制而成的静脉注射液，主要成分是麝香、郁金、冰片、栀子等。近年来有研究报道表明，醒脑静注射液对脑缺血具有一定的保护作用［7－10］。本研究采用双肾双夹法和线栓法建立大鼠高血压脑缺血损伤模型，旨在进一步观察醒脑静注射液对大鼠高血压脑缺血损伤的保护作用，并从拮抗自由基损伤方面探讨醒脑静注射液的脑缺血神经保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性Sprague－Dawley大鼠，6周～8周龄，体重220g±20g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，在北京中医药大学东直门医院动物实验中心进行饲养。

1.2 药品与试剂 醒脑静注射液由无锡济民可信山禾药业股份有限公司生产；青霉素注射液由齐鲁制药有限公司生产；戊巴比妥钠、水合氯醛购自中国医药上海化学试剂公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）、丙二醛（MDA）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器 AUW 220D 电子分析天平（日本岛津）；Beckman J221 型低温超速离心机（美国）；SonicatorXL2020 细胞超声粉碎仪（美国）。

1.4 方法

1.4.1 大鼠双肾双夹肾血管性高血压模型的制备 动物经腹腔注射3%戊巴比妥钠（45mg／kg）麻醉后，固定在鼠板上备皮。常规消毒后，沿腹正中线，胸骨剑突下1cm 处向下行纵行切口，切口长1cm～1.5cm，依次用小直剪剪开皮肤、肌层，打开腹腔。从胃体与肠组织中间缝隙处用消毒棉球隔开，暴露下腔静脉与左肾静脉，止血钳夹小棉球轻擦上述两静脉上腹膜和结缔组织，擦净后可看清下腔静脉左侧伴行的腹主动脉和部分动静脉分支。先做左侧，左肾动脉一般紧贴肾静脉的后上方，用棉球或棉签向下轻压肾静脉直至后方动脉显露出来，若动脉、静脉已由棉球擦拭分离开，此时用玻璃分针挑起左肾动脉，银夹钳夹。右肾动脉位于肠系膜上动脉和下腔静脉之间，先寻找肠系膜上动脉，是腹主动脉右侧较粗的分支，此动脉下约0.2mm 处有一根腹主动脉较细分支，粗细与左肾动脉相似，走向近似平行，此即右肾动脉，同样用银夹钳夹。夹银夹需确认肾动脉夹置于银夹的环形结构，夹尖闭合不会脱落即可，再检查擦拭部位的静脉血流通畅无栓塞，腹腔内无出血，被夹肾动脉无扭转，银夹摆放平整后，取出腹内棉球，创口处洒少量青霉素，然后逐层缝合，肌层采用8字缝合，皮肤采用连续缝合。术后大鼠注意保暖。术后3d每天注射青霉素5 000U～10 000U，预防感染。采用本方法，1个多月后高血压的发生率为100%。

1.4.2 实验分组 采用双肾双夹肾血管进行高血压大鼠模型的制备，1个月后高血压大鼠模型制备成功，将动物随机分为假手术组、模型组、醒脑静给药组。进行局灶脑缺血模型（MCAO）造模后30min，假手术组、模型组生理盐水腹腔注射1次；醒脑静给药组于造模后4h腹腔注射醒脑静注射液（3mL／kg），每隔30min给药1次，共给药3次。

1.4.3 高血压大鼠局灶脑缺血模型的制备 参照Longa等方法加以修改制作右侧大脑中动脉栓塞模型，即使用线栓法造模，放置线栓后不拔掉。10%水合氯醛腹膜腔注射，约5min 后麻醉。仰卧位固定，颈部正中切口。钝性分离颌下腺体，在右侧的肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌之间用眼科平镊钝性分离出右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）及其分支颈外动脉（external carotid artery，ECA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA），避免损伤迷走神经、气管和颌下腺体背面的静脉窦。分离出CCA后，于近心端扎一松结，并结扎CCA 近心端，结扎ECA 近分叉处，暂时夹闭CCA 远心端，用眼科剪在CCA 主干上剪一小口，将尼龙线栓沿切口插入CCA，移去CCA 上的动脉夹，继续将线栓缓慢地向内推进，微遇阻力时停止，然后略向后退回约1mm，此时线栓头端已通过大脑中动脉（middle cerebral artery occlusion reperfusion，MCA）根部，进入大脑前动脉（anterior cerebral artery，ACA）起始部，阻塞了左侧MCA 血流，剪断血管外的线栓，保留残端2mm～3mm。之后将颌下腺归位，缝合皮肤。插线操作超过15min，术中出血多，麻醉过深呼吸不规律，术后3h仍不能苏醒的动物不列入统计范围。术中用100 W 灯泡照射，保证大鼠肛温37 ℃。

1.4.4 神经功能评分的测定 大鼠清醒后，观察其行为学变化，神经症状按Zea－Longa 5分制评分。评分标准，0分：正常，无神经功能缺损；1分：左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，大鼠向左侧（瘫痪侧）转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，大鼠身体向左侧（瘫痪侧）倾倒，重度神经功能缺损；4分：不能自发行走，有意识丧失。

1.4.5 SOD、GSH－Px、MDA 活性的测定 缺血造模24h后，取手术侧半脑（大脑中动脉区域）称重，用冰生理盐水制成10%的脑匀浆，匀浆后离心，取上清液采用比色法测定SOD、GSH－Px、MDA 的活性。

2 结 果

2.1 醒脑静对高血压脑梗死大鼠神经功能的影响 脑缺血24 h后，模型组大鼠神经评分与假手术组相比明显增高。醒脑静给药组较模型组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。

表1 醒脑静对高血压脑梗死大鼠神经功能的影响分

表1 醒脑静对高血压脑梗死大鼠神经功能的影响分

与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

组别 n 神经功能评分假手术组6 0模型组 6 2.4±0.71）醒脑静给药组 6 1.6±0.52）

2.2 醒脑静对缺血脑组织SOD、GSH－Px和MDA 的影响 脑缺血后，模型组大鼠缺血脑组织中SOD、GSH－Px和MDA 活性较假手术组显著降低（P＜0.05）。醒脑静给药组SOD、GSH－Px活性均高于模型组（P＜0.05或P＜0.01），MDA 活性显著低于模型组（P＜0.05）。详见表2。

表2 醒脑静对高血压脑梗死大鼠缺血脑组织中SOD、GSH－Px和MDA 的影响

表2 醒脑静对高血压脑梗死大鼠缺血脑组织中SOD、GSH－Px和MDA 的影响

与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01

组别 n U／（m SgO·D prot）U／G（m SgH·－Ppx rot）nmol／M（m DgA·prot）假手术组 6 10.36±0.72 26.17±1.32 12.98±3.03模型组 6 5.17±1.261） 13.19±1.571）21.50±3.451）醒脑静给药组 6 19.09±3.252）28.32±3.633） 8.41±0.852）

3 讨 论

脑梗死治疗中有效的神经保护剂需要抑制的病理级联反应包括氧化应激、兴奋性毒性、炎症、酸中毒、基质金属蛋白酶激活及血脑屏障破坏［11－13］。其中研究表明，机体的氧化应激状态与脑梗死有着密切联系［14］。这是因为脑组织较其他器官相比更容易产生自由基及脂质过氧化物［15］。在脑梗死缺血性损伤下，因氧耗竭而停滞的烷自由基反应向脂质过氧化物自由基反应过渡，攻击不饱和脂肪酸，机体内产生大量自由基，而其清除自由基的能力下降，致使自由基的产生和抗氧化防御之间严重失衡导致氧化应激反应的产生，ROS在细胞内蓄积引起细胞毒性反应，最终造成神经元损伤。

ROS具有强氧化性，是有氧代谢的副产物，其包括超氧阴离子（O2－）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）、一氧化氮（NO）等［16］。脑梗死后产生大量的ROS超过了生物体的抗氧化防御能力［17］，目前ROS被认为是脑缺血损伤过程中加重神经元损伤的重要因子［2］。ROS在体内直接攻击损伤大分子物质包括蛋白质、脂类和DNA，并发挥着调节因子的作用，包括信号转导、核物质转录、细胞的程序性凋亡等［18－20］。

ROS可快速地被内源性抗氧化物质清除，参与ROS清除的两个系统是抗氧化酶系统和巯基还原缓冲系统，其代表指标分别为SOD 和GSH－Px［21，22］，提高脑组织中这些抗氧化活性物质将有助于脑缺血损伤后神经元的功能恢复。

SOD 活力被认为是机体内最早对抗超氧化自由基的酶，能清除超氧阴离子（O2－），保护细胞免受损伤，其活性间接反映了机体清除氧自由基的能力［23］；GSH－Px是机体内广泛存在的一种重要的催化H2O2分解的酶，特异性地催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用；MDA 是间接反映机体自由基产生水平和体内脂质过氧化代谢情况的重要指标，其含量与过氧化损伤程度成正比，同时也被认为是脂质损伤的重要指标［24］。因此，通过测定MDA、SOD、GSH－Px可反映自由基对脑组织的损伤情况。

醒脑静注射液是根据《温病条辨》安宫牛黄丸组方精制而成的静脉注射液，由麝香、郁金、冰片、栀子等提取有效成分制成，是一种中药复方制剂，可以通过血脑屏障，具有醒神止痉、清热凉血、行气活血、解毒止痛作用。现代药理研究提示，醒脑静注射液具有兴奋中枢、解热、镇痛、抑菌、抗炎、保肝的药效［25］。临床研究表明醒脑静注射液可以治疗脑梗死、脑出血等疾病［26－28］。醒脑静注射液对缺血性脑损伤保护作用机制的实验研究提示其可能是通过干预炎症级联反应［7］、抑制兴奋性氨基酸毒性［8］、抗氧化［9］、抗凋亡［10］等途径起到神经保护的作用。

本研究采用双肾双夹法和线栓法制作了大鼠高血压脑缺血损伤模型，观察醒脑静注射液的神经保护作用。实验结果表明，醒脑静注射液能降低模型大鼠的神经功能评分，减轻脑缺血的病理组织损伤，具有明显的脑保护作用。醒脑静注射液能明显降低MDA 含量，提高SOD、GSH －Px活性，发挥拮抗自由基损伤作用，这可能是醒脑静注射液抗脑缺血损伤的作用机制之一。

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