肌筋膜经线选穴法针刺治疗对脑性瘫痪模型大鼠神经细胞再生及运动功能恢复的影响①

徐冬晨，杨江，喻斌，李达玲，韩新民

肌筋膜经线选穴法针刺治疗对脑性瘫痪模型大鼠神经细胞再生及运动功能恢复的影响①

徐冬晨1，杨江2，喻斌3a，李达玲3a，韩新民3b

目的 探讨基于肌筋膜经线的选穴法针刺治疗对脑瘫模型大鼠神经细胞再生及运动功能恢复的影响。方法健康21日龄雄性Sprague-Dawley大鼠20只，分成对照组、针刺1组、针刺2组和假手术组，对照组、针刺1组和针刺2组采用左侧颈总动脉结扎结合低氧环境制作脑瘫模型。针刺1组接受传统针刺疗法，针刺2组接受基于肌筋膜经线的选穴法针刺治疗。各组于针刺开始后第3、7、14天行BBB评分、斜板试验；第14天用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记检测左脑运动皮层和纹状体的细胞增殖情况。结果第7天和第14天针刺2组的BBB评分恢复明显优于针刺1组和对照组(P＜0.01)，第3、7、14天针刺2组斜板支撑能力均较对照组升高(P≤0.05)；第14天针刺2组运动皮层BrdU含量较针刺1组升高(P＜0.05)。结论基于肌筋膜经线的选穴法针刺治疗能有效促进脑瘫模型神经细胞再生和运动功能的改善，且优于传统针刺疗法。

脑性瘫痪；肌筋膜经线；针刺；穴位；5-溴脱氧尿核苷；运动功能；大鼠

[本文著录格式]徐冬晨，杨江，喻斌，等.肌筋膜经线选穴法针刺治疗对脑性瘫痪模型大鼠神经细胞再生及运动功能恢复的影响[J].中国康复理论与实践,2014,20(3):206-210.

针刺疗法在脑瘫康复治疗中对运动功能改善的临床疗效肯定。由于针刺选穴方法以中医理论为指导且多样化，加上中枢神经再生的复杂性，如何利用针刺更有效促进脑瘫患者运动功能恢复，仍然是当前临床和康复治疗的重点和难点。本研究观察两种针刺疗法对脑瘫模型大鼠神经细胞再生和运动功能恢复的影响，初步明确选穴新法的有效性和可行性，为提高针刺治疗脑瘫疗效提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

健康21日龄雄性Sprague-Dawley大鼠20只，体重40～50 g，由南京江宁动物养殖场提供，动物质量合格证号：SCXK(浙)20080033。将大鼠分为4组，即假手术组、对照组、针刺1组(采用传统针刺疗法)和针刺2组(采用新型针刺疗法)，每组5只。

1.2 主要仪器及试剂

IX71荧光倒置显微镜：日本OLYMPUS。5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)：南京奥生化学技术有限公司，批号ASBC3004。抗BrdU一抗：武汉博士德生物工程有限公司，批号BM0201。羊抗鼠-FITC二抗：北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZF-0317。DAPI染色试剂盒：南京凯基生物科技发展有限公司，批号KGA215。8%氧气+92%氮气混合气体：南京上元工业气体厂。

1.3 动物模型的建立

参照文献[1]，对照组、针刺1组、针刺2组均采用左侧颈总动脉结扎法结合低氧环境制作脑瘫模型。大鼠乙醚吸入麻醉或局麻后固定台上，呈仰卧位。颈腹侧正中切口，分离左颈总动脉并结扎。缝合切口，青霉素注射液冲洗局部皮肤，放入37℃恒温水浴容器中恢复2 h，然后放置密闭容器。1 L/min通入低氧气体(8%氧气+92%氮气的混合气体)，2 h后取出，1 h后行行为测定。翻身不能、平衡异常和左旋者视为成功模型，返回鼠笼中饲养。假手术组仅切开颈部皮肤，不做结扎，余同脑瘫模型。

1.4 治疗方法

造模后24 h，针刺1组采取脑瘫动物实验常用处方，取患侧百会、颞Ⅰ针、曲池、内关、足三里、涌泉[2-8]。针刺2组选穴与针刺1组部位对应，即在头部、前肢、后肢各取2个腧穴，并根据大鼠软瘫的表现和由屈曲向伸展发育的规律，重点改善肢体伸展能力，在浅背线、上臂线之背臂线、下肢部深前线等肌筋膜经线上初步找寻12个穴位，再利用电针刺激选择出能以最小刺激引起系列靶肌肉收缩的穴位：络却、率谷、外关、肩贞、承扶、三阴交。具体定位参照《实验针灸学》[9]，结合人与大鼠骨度类比。

固定大鼠，针刺，每次留针20 min，连续针刺14 d。假手术组、对照组不进行干预，自然恢复。第8天开始，各组每天腹腔注射BrdU 50 mg/kg。

1.5 观察指标

1.5.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分[10-11]各组大鼠均在针刺开始后第3、7、14天行BBB评分。将大鼠放置于宽大活动场地，观察右侧后肢关节活动的数目和范围、负重程度及前后肢协调性、前后爪和尾部活动情况，根据BBB评分标准评分。

1.5.2 斜板试验[12]各组大鼠于针刺开始后第3、7、14天进行斜板试验。将大鼠放置于自制斜板上，身体轴线与斜板纵轴垂直，将木板由0°轻轻抬起，每次升高5°，记录大鼠能停留5 s的最大角度。

1.5.3 BrdU检测 脱颈断头处死大鼠，立即取运动皮层和纹状体组织，放入10%甲醛中。常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚30 μm。切片60℃恒温箱烘烤60 min；二甲苯浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min；分别用100%、95%、85%、70%乙醇浸泡各5 min；PBS洗涤5 min，共3次。放入缓冲液，煮沸20 min，浸入流水中自然冷却；PBS洗涤5 min，共3次。3%H2O2-甲醇溶液处理切片15 min，PBS洗涤5 min，共3次；一抗1∶100稀释后，每张切片加50 μl，37℃孵育2 h；PBS洗涤5 min，共3次。加入羊抗鼠-FITC二抗50 μl，37℃孵育30 min；PBS洗涤5 min，共5次；加DAPI染液，避光反应5 min；PBS洗涤5 min，共5次。晾干后加防萃灭树胶，加盖玻片；荧光显微镜下观察。绿色亮点为BrdU阳性染色。结果用IPP 6.0计算荧光值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 BBB评分

大鼠造模术后患肢BBB评分均为0分。对照组、针刺1组、针刺2组时间主效应不显著(F=3.894,P= 0.143)；加入假手术组后，时间(F=25.970,P=0.000)及时间×处理方法(F=4.479,P=0.002)主效应显著。单因素方差分析显示，各时间点组间均有非常高度显著性差异(P＜0.001)；LSD-t检验，针刺开始后第3、7和14天，对照组、针刺1组、针刺2组BBB评分均显著低于假手术组(P＜0.001)，第3天针刺1组、针刺2组、对照组两两之间均无显著性差异(P＞0.05)。第7、14天BBB评分针刺2组优于针刺1组和对照组(P＜0.01)，针刺1组与对照组无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 术后大鼠BBB评分

2.2 斜板试验

大鼠造模术后支撑能力明显降低(P＜0.01)，对照组、针刺1组、针刺2组重复测量方差分析时间主效应不显著(F=3.858,P=0.145)；加入假手术组后，时间主效应显著(F=4.189,P=0.024)，时间×处理方法主效应不显著(F=0.818,P=0.564)。单因素方差分析显示，各时间点组间均有显著性差异(P＜0.05)；LSD-t检验，针刺开始后第3、7、14天，对照组、针刺1组、针刺2组支撑能力均低于假手术组(P＜0.05)，其中针刺1组、针刺2组支撑能力均强于对照组(P＜0.05)，但两组间无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表2 术后大鼠斜板试验结果(°)

2.3 BrdU

对照组、针刺1组、针刺2组运动皮层和纹状体BrdU荧光值均低于假手术组(P＜0.05)，针刺1组、针刺2组明显高于对照组(P＜0.01)；而针刺2组与针刺1组比较，运动皮层荧光值有显著性差异(P＜0.05)，纹状体荧光值无显著性差异(P＞0.05)。见表3、图1、图2。

图1 皮层BrdU的表达(免疫荧光染色，200×)

图2 纹状体BrdU的表达(免疫荧光染色，200×)

3 讨论

2001年Myers提出肌筋膜经线，超越单一肌肉思维，建立了肌肉的整体观念[13]，为针刺疗法奠定现代生物学意义上的物质基础和机能学基础，也为针刺疗法研究摆脱传统经验医学模式，向生物医学模式过渡提供了理论依据，在中医领域的相关研究前景广阔。

传统的针刺选穴原则包括近部选穴、远部选穴、对症选穴；而依据肌筋膜经线进行选穴，是在生物学基础上，根据肌筋膜经线走向特点、肌筋膜分布-运动方向对应关系，确定针刺部位、深度等，从而为穴位的筛选提供一定理论依据。对其进行深入挖掘可能对中医的现代生物学研究具有重要意义。本研究尝试在中医针刺领域初步探讨基于肌筋膜经线的选穴新法的有效性和可行性，为提高针刺治疗脑瘫疗效提供新的思路。

幼鼠脑缺血缺氧后，部分细胞变性、坏死，出现典型的凋亡，神经元增殖与分化减少[2,7,14-16]，适当的条件，如针刺治疗[2-4,8,17]，会促进神经干细胞产生增殖、分化，并迁移到脑损伤区，参与神经的修复过程，减轻脑部损伤，促进功能恢复。

目前BrdU是检测细胞增殖的常用方法[18-21]。BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，能够在细胞增殖期的DNA合成期(S期)代替胸腺嘧啶掺入到正在复制的DNA分子中，而BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而评价细胞的增殖能力。该法具有简单、迅速、直观、敏感、准确性高、重复性好等特点。本研究结果显示，针刺1组运动皮层BrdU荧光值高于针刺2组；运动功能评价显示，针刺2组大鼠运动功能的恢复优于针刺1组，表明基于肌筋膜经线的选穴法对细胞增殖和运动功能恢复的促进作用优于传统选穴方法。基于肌筋膜经线的选穴法有效、可行，对临床基于肌筋膜经线选穴针刺治疗脑瘫提供了参考。

与传统选穴方法比较，基于肌筋膜经线的选穴新法对促进细胞的增殖在纹状体未见显著性差异，显示出脑区的特异性；在运动功能方面也表现出某些特异性，对后续研究的设计提供了新的参考。另外，基于肌筋膜经线的选穴新法是否就可以完全取代传统选穴方法，适应范围有多大等，本研究尚不能做出定论，仍需后续全面的深入研究。

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Effects of Acupuncture Based on Acupoint Selection of Myofascial Meridians Perspective on Regeneration of Nerve Cells and Recovery of Motor Function in Rats with Cerebral Palsy

XU Dong-chen,YANG Jiang,YU Bin,et al.Department of Rehabilitation Science, Nanjing Technical College of Special Education,Nanjing 210000,Jiangsu,China

ObjectiveTo investigate the effects of acupuncture based on acupoint selection of myofascial meridians perspective on the regeneration of nerve cells and recovery of motor function in rats with cerebral palsy.Methods20 healthy 21-day-old male Sprague-Dawley rats were divided into control group,acupuncture groups 1(receiving traditional acupuncture)and 2(receiving acupuncture based on acupoint selection of myofascial meridians perspective),and sham group.The control group and the acupuncture groups were subjected to ligation of left carotid artery(ischemia)and then put into a hypoxic environment.They were assessed with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB) Scale and inclined plane test 3 d,7 d and 14 d after the beginning of acupuncture.And 5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)was used to label S-phase cells in the left striaturn and motor cortex in each group 14 d after the beginning of acupuncture.ResultsThe BBB scores improved more in the acupuncture group 2 than in the acupuncture group 1 and the control group 7 d,14 d after the beginning of acupuncture(P＜0.01),as well as the score of inclined plane test 3 d,7 d,14 d after acupuncture(P＜0.05).BrdU was more in the left motor cortex in the acupuncture group 2 than in the acupuncture group 1(P＜0.05).ConclusionAcupuncture based on acupoint selection of myofascial meridians perspective can promote the regeneration of nerve cells and recovery of motor function in rats with cerebral palsy,that is more effective than traditional acupuncture.

cerebral palsy;myofascial meridian;acupuncture;acupoint;5-bromodeoxyuridine;motor function;rats

R742.3

A

1006-9771(2014)03-0206-05

2013-05-23

2013-07-10)

1.南京中医药大学中医儿科学重点学科开放课题资助项目(No.EZK2012011)；2.江苏高校“青蓝工程”资助项目。

1.南京特殊教育职业技术学院康复科学系，江苏南京市210000；2.南京中医药大学附属医院儿科，江苏南京市210000；3.南京中医药大学，a.药学院；b.第一临床医学院，江苏南京市210000。作者简介：徐冬晨(1977-)，男，江苏江阴市人，硕士，副教授，主要研究方向：儿童康复。通讯作者：韩新民。

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.03.002