p53与MDM2基因多态性和东北女性乳腺癌发病风险的相关性研究

关舒，曹彧，王玉颖，陈思，毛晓韵，陈波，姚凡，吴云飞，李继光，金锋

（中国医科大学附属第一医院乳腺外科，沈阳 110001）

乳腺癌是中国东北地区女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其发病机制复杂，涉及多因素、多突变积累过程。p53作为重要的肿瘤抑癌基因，参与细胞周期调控、DNA损伤修复、细胞分化及凋亡等重要生物学行为。最近研究显示p53基因第4外显子第72位密码子多态性（p53 Arg72Pro；G→C改变导致精氨酸（Arg）被脯氨酸（Pro）取代）与多种肿瘤遗传易感性密切相关［1，2］。鼠双微基因（Mouse double minute 2，MDM2）作为细胞内调节p53蛋白浓度及活性最为关键的负性调控因子，与p53构成负反馈环路，抑制其转录活性；同时MDM2借助其E3泛素连接酶活性，导致p53蛋白降解，从而减弱p53对细胞周期调控作用［3，4］。最近研究发现MDM2内含子区内的p53反应启动子区存在功能性单核苷酸多态性（SNPT309G）可显著增加MDM2与转录因子Spl亲和力，使MDM2蛋白表达水平增高，减弱p53信号通路的传导功能［5］。由此可见，抑癌基因p53和其负性调控基因MDM2在乳腺癌发生发展中可能起着重要作用。因此，本研究采用病例对照研究分析p53 Arg72Pro和MDM2 T309G多态性与中国东北人群乳腺癌发病风险及临床病理参数之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集中国医科大学附属第一医院乳腺外科2006年10月至2008年6月女性乳腺癌305例，年龄22~85岁，中位年龄50.1岁。患者病理经2位病理医生按世界卫生组织（WHO）《乳腺病理组织学分类》（2003新版）标准读片确认其病理类型，其中浸润性导管癌262例（85.9%）；浸润性小叶癌10例（3.3%）；其他类型癌33例（10.8%）。其中临床分期Ⅰ~Ⅱ期占83.9%（256例）、存在淋巴结转移的患者占37%（113例），其中ER阳性181例（59.3%），ER阴性124例（40.7%）。对照组为中国医科大学附属第一医院乳腺外科2006年10月至2008年6月女性良性乳腺病变345例（病理类型为乳腺病），年龄24~87岁，中位年龄48.7岁。

1.2 DNA提取

抽取以上病例空腹外周静脉血样本约5 mL，置于EDTA抗凝管中，-80℃冰箱保存备用，用酚氯仿法提取全血样本的基因组DNA，用NanoDrop 1000紫外分光光度计测定核酸质量及浓度，并全部标准化为10 ng/μL。

1.3 SNP检测

应用Real⁃time PCR方法检测。p53 Arg72Pro（rs1042522）的TaqMan探针标识序列为：TCCCAGAATGCCAGAGGCTGC TCCCC［C/G］CGTG GCCCCTGCACCAGCAGCTCCT；其中VIC标记位点中的C基因型，FAM标记位点中的G基因型。MDM2 T309G（rs2279744）的TaqMan探针标识序列为 GCATCACTCCACTTTCCCCCTAACTA［C/T］TAT CAATTTCCTCCATGATCCAAAA；将配制好的20μL反应体系进行扩增，反应条件为：95℃/30 s，之后95℃/5 s→60℃/20 s循环45次，每次循环末尾采集FAM和HEX（与VIC通道相同）通道信号。待反应结束后通过Mxpro2.0软件保存并分析结果。

1.4 统计学处理

统计学分析应用统计分析软件包SPSS16.0计算。采用χ2检验确定基因型频率是否符合Hardy⁃Weinberg平衡，比较基因型的组间分布频率，分析不同基因型与乳腺癌临床病理特征的相关性。采用非条件Logistic回归分析计算比值比（odds ratios，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI），分析不同基因型与乳腺癌风险和临床病理特征之间的相关性，并排除年龄和绝经状况等混杂因素的影响。所有的统计学检验均为双侧概率检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p53 Arg72Pro和MDM2 T309G多态性及Hardy⁃Weinberg平衡检验（表1）

表1 p53 Arg72Pro、MDM2 T309G基因型分布频率及与乳腺癌发病风险的相关性Tab.1 The frequency distribution of p53 Arg72Pro、MDM2 T309G genotype and their association with breast cancer risk

在病例组及对照组人群中，p53 Arg72Pro和MDM2 T309G各基因型分布频率均符合Hardy⁃Weinberg平衡。p53 Arg72Pro GC、GG及GC/GG基因型与CC基因型相比可显著提高乳腺癌发病风险（GC vs CC：P=0.037，OR=1.488，95%CI：1.023~2.164；GCvs CC：P<0.001，OR=2.747，95%CI：1.760~4.286；GC/GG vs CC：P=0.001，OR=1.811，95%CI：1.272~2.576），见表1。MDM2 T309GTT基因型亦与乳腺癌易感性密切相关（P=0.007，OR=1.833，95%CI：1.181~2.846）、即携带MDM2 T309GT等位基因的乳腺癌发病风险大（Tvs G：P=0.013，OR=1.323，95%CI：1.061~1.649）。

2.2 p53 Arg72Pro和MDM2 T309G基因型频率与乳腺癌临床病理特征的关系

p53 Arg72Pro的多态性与乳腺癌病理类型相关，浸润性小叶癌患者携带p53 Arg72Pro GC+GG基因型中的比率（40.0%）明显低于浸润性导管癌的患者（80.5%）（P=0.007）。ER阳性乳腺癌患者携带MDM2 T309GTG+TT基因型的比率（62.4%）明显低于ER阴性乳腺癌患者（76.6%）（P=0.009）。此外，我们并未发现p53 Arg72Pro和MDM2 T309G不同基因型与患者的年龄、绝经状态、肿瘤大小、淋巴结转移情况及PR、HER2状态在分布频率上存在统计学差异（P>0.05），见表2。

3 讨论

乳腺癌发生的原因复杂，其发病机制尚未研究清楚，一般认为受环境因素和遗传因素共同作用。p53蛋白作为一种转录因子，可通过调节下游一系列靶基因表达对DNA损伤等做出反应。MDM2作为下游靶基因之一，对p53通路发挥关键的负性调控作用。最近研究证实癌基因MDM2或抑癌基因p53的功能获得或缺失都有可能导致乳腺细胞的异常生长，甚至癌变的发生。一些国外相关研究［1，2，6，12］表明，p53 Arg72Pro和MDM2 T309G多态性与乳腺癌的易感性密切相关，因此本研究分析了p53 Arg72Pro和MDM2 T309G多态性与中国东北地区人群乳腺癌易感性及相关临床病理参数之间的相关性。

表2 p53 Arg72Pro、MDM2 T309G基因型分布频率与乳腺癌患者临床病理参数的相关性Tab.2 Correlations of p53 Arg72Pro、MDM2 T309G genotypes with clinicopathological parameters in patients with breast cancer

本病例对照研究结果发现，p53 Arg72Pro多态性中，与CC基因型相比，GG基因型能够增加2.7倍的发病风险，而GC基因型能够增加1.5倍发病风险，病例组与对照组的GG基因型频率分别为17.1%和30.5%。等位基因G增加乳腺癌的发病风险1.66倍。由于环境暴露及遗传背景上的差异，基因多态性对于不同人群乳腺癌易感性的影响可能并不相同。国内外关于p53 Arg72Pro多态性与乳腺癌风险相关性研究得出了有争议的结论。Damin等［1］对巴西人群以及Gochhait等［2］对印度人群的研究均与本研究结果一致，认为G等位基因为乳腺癌发病的危险因素。然而，Akkiprik等［6］对土耳其人群的研究报道提示C等位基因为乳腺癌的风险基因。Hou等［7］进行的一项Meta分析显示，p53 Arg72Pro多态性与乳腺癌发病风险无明显相关性。本研究同时发现，GC+GG基因型中浸润性导管癌的比率比CC基因型高，CC基因型中浸润性小叶癌比率明显增高。这与Tommiska等［8］研究结果一致。如此可见，若要明确p53多态性与乳腺癌的确切关系，尚需要进一步阐明多态性位点的功能以及进一步扩大样本量来进行不同肿瘤间及不同人群中的多个位点基因多态性的研究。

本研究关于MDM2 T309G多态性结果发现，与GG基因型相比，TT基因型能够增加1.83倍的发病风险，等位基因T增加乳腺癌的发病风险1.32倍。目前国内外关于MDM2 T309G与乳腺癌易感性研究的结果并不一致。Lum等［9］研究发现上海人群中MDM2 T309G与乳腺癌发病风险密切相关；而另外一项实验的欧洲人群及非洲裔人群中，并未发现MDM2 T309G与乳腺癌发病风险相关［10］；吴灿等［11］研究并未发现MDM2 T309G与乳腺癌发病风险相关，但进一步分层分析发现绝经后人群携带T/G型或G/G型可使乳腺癌发病风险升高1.8倍。最近台湾地区的研究显示，MDM2 T309GG/G及T/G型与乳腺癌发病风险增高相关［12］；可见，MDM2 T309G与女性乳腺癌发病风险的关系的结论并不一致，可能与p53、MDM2形成的反馈调节通路的复杂性相关，具体内在作用机制仍需探讨，另外本研究结果是基于中国北方女性人群，应在其他人群或其他肿瘤类型中进一步证实。综上所述，p53 Arg72Pro和MDM2 T309G为中国人重要的乳腺癌遗传易感候选分子，可作为乳腺癌高危人群的筛选指标之一。

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