噬菌体展示筛选人源细胞黏附分子L1结构域抗体及其体外实验研究

赵炜疆，潘洪超，李桂林，董丽萍，唐丹阳

（1.汕头大学医学院神经科学中心，广东汕头 515041；2.首都医科大学北京市神经外科研究所，北京 100050）

脊髓损伤是严重的神经系统创伤性疾病，对抗损伤后出血、水肿、微循环障碍以及局部氧自由基作用所造成的神经元损伤，促进损伤后神经系统功能恢复、改善临床症状是治疗脊髓损伤的重要目的。L1系免疫球蛋白超家族成员，主要表达于分化中的神经元轴突及生长锥，参与神经细胞迁移、存活以及神经突形成［1－2］，在损伤后神经再生中发挥重要作用。已有报道使用小鼠源性激动型L1抗体可激活L1功能，增强周围神经轴突再生和髓鞘形成，促进损伤后功能恢复［3－4］。这些提示激活脊髓损伤部位L1，进而激活一系列与创伤修复有关的信号级联反应可能是促进脊髓损伤后结构重建和功能恢复的重要环节。本实验拟通过噬菌体展示技术筛选并纯化针对L1 FN2-3区的人源结构域抗体，并检测其抗原结合特性和对L1下游信号激活、神经突生长及神经细胞聚集的影响，进而为实验性治疗研究神经损伤打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料 人结构域抗体库（Human Domain Antibody Library，DAb library）购自 Source BioScience LifeSciencesTM（Nottingham，英国）；人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（CTCC）。DMEM-F12低糖培养液及青霉素／链霉素、RIPA细胞裂解液（北京索莱宝公司）；胎牛血清（杭州四季青生物技术有限公司）；8孔Lab-Tek小室载玻片 （Nunc公司）。小鼠抗pErk1／2、Erk、pAkt1及 Akt1抗体（Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，美国），兔抗c-Myc抗体（生工生物，上海），小鼠抗GAPDH抗体（江苏碧云天生物技术研究所），ECL超敏发光液 （Biorad，美国）及Pro-Long Gold Antifade reagent with DAPI抗荧光衰减封片剂 （Life technologies，美国）。驴抗小鼠DylightTM488及驴抗兔DylightTM594荧光二抗（Jackson Immuno Research公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体展示技术筛选L1结构域抗体 ①

包被：将100μl溶于 PBS的 L1 FN2-3肽段（浓度200 mg·L－1）包被于96孔板中，4℃过夜，吸出未包被上的液体，用200μl 3%BSA在室温下封闭1 h。②结合：弃去封闭液将滴度为1013的人结构域噬菌体抗体库（溶于100μl PBS）加入包被好的孔中，室温下孵育1 h。③洗脱：将未结合的噬菌体吸出，用200μl含0.1%Tween-20的PBS（PBST），室温下洗脱10次，每次1 min，然后用200μl PBS洗脱2次，每次10 min。最后，加入100 mg·L－1胰蛋白酶，室温下孵育30 min。④ 接种：吸出噬菌体，加入到预先培养好的600 nm OD值为0.4的30 ml新鲜大肠杆菌TG1菌液中，37℃下振荡孵育1 h。然后，将菌液在3 200×g下离心10 min，将被噬菌体侵染的大肠杆菌溶于1 ml 2×TY培养基中。取出10μl，梯度稀释接种于预热的含100 mg·L－1青霉素的TYE板上进行滴度测定，剩余菌液4℃12 000×g离心5 min后用50μl 2×TY培养基重悬沉淀，接种于TYE平板上于恒温培养箱中37℃过夜。⑤扩增：利用培养液洗脱菌落，溶于50 ml 2×TY培养液中，当菌落生长至 OD600nm为0.4时，加入 1010辅助噬菌体KM13，置于37℃水浴1 h。然后离心，并加入50 ml新鲜培养液（含100 mg·L－1氨苄霉素和50 mg·L－1卡那霉素以及1%葡萄糖），放置于恒温摇床，250 r·min－1振荡，37℃过夜。再次将菌液3 200×g离心10 min。收集上清，按照1∶4的比例加入聚乙二醇／氯化钠溶液，置于冰上1 h。随后，12 000×g离心10 min。最后将提取的噬菌体10μl梯度稀释，均匀涂布在TYE板（含有100 mg·L－1氨苄霉素，1%葡萄糖）上，置于37℃恒温培养箱中，孵育过夜，选取1016·L－1噬菌体进行次轮筛选。第2轮和第3轮的筛选步骤与第1轮相似，不同之处在于洗脱过程中分别采用含有0.3%PBST和0.5%PBST洗脱。

1.2.2 噬菌体ELISA 首先，将第3轮扩增所收集的富集克隆接种在TYE板（含100 mg·L－1氨苄霉素，1%葡萄糖）上，编号后挑选单克隆进行扩增。然后，将100μl浓度200 mg·L－1FN2-3肽段包被于ELISA板孔中，4℃过夜。后续过程参考 Lee等［5］方法进行。使用Tecan全波长酶标仪测定450 nm波长下的吸光度值，并提取吸光度值高于对照组的噬菌体DNA进行测序、表达和纯化。

1.2.3 结构域抗体表达及纯化 参考Lee等［5］方法进行抗体扩增。使用c-Myc标签蛋白纯化试剂盒结纯化构域抗体。将500μl滤过后的上清加入纯化柱中，随后加入40μl抗c-Myc珠子，4℃缓慢颠倒孵育1 h，然后12 000×g离心10 s。之后加入200μl PBS4℃12 000×g离心 10 s洗脱非特异性结合，重复3次。向纯化柱中加入40μl c-Myc洗脱肽，4℃孵育5 min，竞争性结合抗 c-Myc珠子，4℃下12 000×g离心10 s，收集离心管中的液体，为纯化的单链抗体蛋白并分装，于－20℃保存。

选用BSA标准蛋白考马斯亮蓝染色进行单链抗体蛋白浓度测定。纯化的单链抗体和BSA标准蛋白通过10%的SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色液染色、脱色后利用Image J软件分析蛋白质考马斯亮蓝染色的灰度值，根据BSA标准蛋白的灰度值，计算单链抗体的浓度。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测噬菌体－抗原结合及抗体－抗原结合 具体过程同噬菌体ELISA，仅将噬菌体改为200μg·L－1结构域抗体。然后每孔加入100μl稀释于3%BSA的兔抗c-Myc多克隆抗体的溶液（1∶1 000），室温下孵育1 h；之后加入100μl稀释于3%BSA的HRP标记的羊抗兔二抗（1∶2 000），室温下孵育1 h。每次孵育后均使用0.1%PBST洗脱5 min×3次。TMB显色10 min，之后加入50μl 1 mol·L－1硫酸终止显色反应，并使用Tecan全波长酶标仪测定450 nm波长下的吸光度值。

1.2.5 细胞培养 SK-N-SH细胞常规培养于75 cm2培养皿，DMEM-F12低糖培养液含10%胎牛血清，50 U·L－1青霉素／链霉素；温度37℃，5%CO2。

1.2.6 免疫荧光染色检测抗体与内源性L1结合SK-N-SH细胞（2×104／孔）接种于8孔 Lab-Tek细胞小室中，培养48 h后使用4%多聚甲醛固定15 min，PBS轻洗5 min。10%驴血清室温封闭 60 min，然后加入小鼠抗L1（1∶200）及H2-1抗体（200 μg·L－1）混合液4℃孵育过夜。之后加入兔抗c-Myc抗体（1∶200）室温孵育2 h。上述过程结束后，加入驴抗小鼠 DylightTM（488）和驴抗兔 DylightTM（594）二抗（1∶500）混合液，室温孵育2 h。每次孵育过程结束后均使用PBS洗涤5 min×3次。抗荧光衰减封片液封片，激光共聚焦显微镜 （FV-1000，Olympus公司）下观察并采集图像。

1.2.7 H2-1结构域抗体对L1信号通路激活的影响 SK-N-SH细胞（5×104／孔）过夜培养于48孔板中，待细胞充分贴壁后，弃去常规培养液，分别加入新鲜培养液，并分别给予溶剂对照0及50μg·L－1H2-1抗体，作用48 h后裂解细胞，行Western blot检测。

1.2.8 Western blot 约30μg细胞裂解液95℃变性10 min，加样电泳，积层胶（5%）中恒压80V，进入分离胶（10%）后改恒压150 V。采用湿转法300 mA转膜3 h，以5%BSA室温封闭1 h，之后分别加入小鼠抗Erk及pErk1／2抗体（均为1∶1 000），以及小鼠抗Akt1及pAkt1抗体（均为1∶500）、小鼠抗GAPDH抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜。之后用HRP标记驴抗小鼠二抗（1∶1 000）室温孵育1 h。每次孵育结束后以TBST洗涤5 min×3次。使用超敏发光法检测蛋白质水平，凝胶图像分析仪（Multi-imageⅢ，Alpha Innotech公司）采集化学发光信号。

1.2.9 H2-1抗体对SK-N-SH细胞神经突生长及细胞聚集的影响 SK-N-SH细胞（2×104／孔）接种于8孔Lab-Tek细胞小室中，培养过夜后弃除培养液，分别加入溶剂对照0及50μg·L－1抗体，48 h后使用4%多聚甲醛固定15 min，PBS轻洗5 min。之后行0.1%结晶紫4℃染色过夜。PBS轻洗5 min×3次，室温下干燥后于200倍倒置显微镜下观察并拍摄神经突生长及细胞聚集情况。

1.3 统计学分析 结果用¯x±s表示，用统计软件SPSS10.0分析，采用独立样本t检验比较两组间差异。

Fig 1 Phage ELISA for the identification of positive clones and purification and concentration determination of H2-1 antibody

2 结果

2.1 阳性克隆筛选及噬菌体抗体表达及纯化 经3轮淘选后于TYE平板上随机挑取24个克隆，并经噬菌体ELISA检测后，确定阳性克隆8个，分别命名为H2-1至H2-8，其中成功地对H2-1及H2-1噬菌体DNA进行了测序。将噬菌体H2-1及H2-1转染至大肠杆菌HB2151，经表达纯化后，仅获得H2-1克隆所表达的抗体，其浓度为200μg·L－1。Fig 1A～C示。

2．2 结构域抗体与抗原结合力及与内源性L1结合检测 ELISA结果显示抗体H2-1与抗原多肽的结合力是对照组4倍，提示结构域抗体自身可与抗原结合。免疫荧光显示，SK-N-SH细胞L1成点状排布于细胞膜表面，抗体标签c-Myc信号与L1信号有较好的重合，提示H2-1抗体与细胞内源性L1结合良好，为后续信号通路及动物实验性治疗研究提供了重要依据。Fig 2A～B示。

2．3 结构域抗体对L1信号通路的影响 给予H2-1抗体24 h可明显促进Erk及Akt1磷酸化，磷酸化水平分别为对照组的17.44±5.66和1.84±0.49倍（与对照组相比，分别为P＜0.01和P＜0.05），提示该抗体可同时激活Erk及Akt1这两条与L1功能密切相关的信号通路。Fig 3A示。

2．4 结构域抗体对SK-N-SH细胞聚集的影响 与对照组及溶剂对照组相比，给予SK-N-SH细胞H2-1抗体50μg·L－148 h可明显促进SK-N-SH细胞神经突生长及胞体聚集。Fig 3B示。

3 讨论

L1是免疫球蛋白超家族成员，研究证明神经细胞黏附分子L1可以同亲和（自身结合）或异亲和（与其他分子作用）方式对抗损伤后修复抑制分子，促进轴突外生，从而有助于神经再生［6－9］。噬菌体展示技术已成为结合肽、模拟肽以及拮抗型抗体筛选的重要工具［10］。本研究利用噬菌体展示技术成功筛选出可特异性结合细胞黏附分子L1 FN2-3区的激动型抗体，促进L1下游信号分子Erk及Akt1磷酸化激活，并促进神经来源SK-N-SH细胞神经突生长及细胞聚集。

Fig 2 Affinity evaluation of H2-1 antibody to FNⅡ-Ⅲ domain through ELISA and immunofluorescence

Fig 3 Effects of H2-1 antibody on L1 related cell signaling and cell accumulation in SK-N-SH cells

超表达L1的干细胞或施旺细胞、表达L1的腺相关病毒以及融合人免疫球蛋白Fc段的L1细胞外结构域（ECD-Fc）的应用可在急、慢性神经系统损伤模型中增强神经元再生、促进成年大鼠挫伤性脊髓损伤后运动系统的康复［7］。本研究筛选的激动型L1抗体H2-1的促神经突生长及细胞聚集作用，可能系通过与L1 FN2-3区特异性结合，改变该区域构象，易化L1与同一细胞邻近分子或相邻细胞上的分子发生同亲和或异亲和作用实现的（Fig 4）。L1激动型抗体克服了L1 ECD-Fc分子质量大、难以大量生产和应用的缺点。以往研究通过传统杂交瘤技术获得的小鼠抗体557.B6以及重组scFv片段G6-cys，可结合小鼠L1第2个和第3个纤连蛋白Ⅲ（FNIII）重复片段［3－4］，能以激动剂的形式刺激或触发小鼠L1功能，因此对神经生成以及神经元存活发挥有益作用。但鼠源性抗体用于临床治疗，不可避免地存在异种排斥、效价降低等问题，本研究筛选的人源结构域抗体分子质量仅为scFv抗体的1／2（14 ku），具有分子质量小、易于生产、更易穿过血－脊髓屏障等特点，具有更优越的潜在临床治疗价值。

以上研究为深入了解激动型L1抗体治疗脊髓损伤提供依据，为人源该抗体的应用提供前瞻性的理论实证，并进一步为其在脊髓损伤的实验治疗研究打下基础。然而，如何提高抗体效价、防止在体实验中二聚体形成，以及L1激动型抗体如何与其他神经损伤治疗药物联合应用是未来研究中需要解决的问题。

Fig 4 Schematic diagram showing the activation of potential H2-1 antibody-activated signaling pathway，which may contribute to enhanced L1 functions，including neurite outgrowth and cell accumulation.

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