适合豆乳发酵的乳酸菌筛选及其应用*

陈涛，马映昆，陈福生

1(环境食品学教育部重点实验室，湖北武汉，430070)2(华中农业大学食品科技学院，湖北武汉，430070)

酸豆乳是一种以新鲜豆乳为原料，经乳酸菌发酵而成的风味独特、营养丰富的新型功能性豆制品，它既能发挥大豆的营养功效，又能减少大豆中的不良因子，具有改善血压、调节血脂等多方面的功能［1－2］。酸豆乳含有丰富的植物蛋白、不饱和脂肪酸、人体必需的18种氨基酸和提高人体免疫机能的大豆低聚糖和大豆异黄酮等功能成分，且不含胆固醇和乳糖，是高血压及乳糖不耐症患者的良好选择［3］。

国内外对微生物发酵制作酸豆乳进行了广泛的研究，这些研究主要集中在发酵条件［3－4］，酸豆乳的风味［5－7］，营养成分及活性物质［8－10］等方面。已有的研究表明发酵菌种的特性和发酵条件对酸豆乳的感官品质和营养价值影响很大。本课题组前期从某醋厂酒醅中筛选鉴定了28株乳酸菌，综合益生特性，从中选择了生长特性较好的10株菌用于酸豆乳发酵。本研究通过驯化和筛选，从10株乳酸菌中筛选了1株发酵乳杆菌(L6－2)和1株干酪乳杆菌(L4－4)，其中L4－4表现出较强的酸化能力和分解作用，产生的风味较好，L6－2发酵酸乳组织状态优良，后酸化能力较弱，利于酸乳的贮存，因此考虑将二者进行混合发酵，以期综合2株菌的优点。以筛选得到的2株乳酸菌为发酵菌种，以大豆和和脱脂奶粉为原料，通过单因素实验研究了混合发酵制作酸豆乳的条件，比较了混合发酵和单菌株发酵感官指标和主要营养成分的差异。本研究为酸豆乳食品的开发提供了参考，具有一定的应用前景。

1 材料与方法

1.1 原料

1.1.1 原料和试剂

大豆，脱脂奶粉，市售;菌株:乳酸菌L3－2，L3－3，L4 －1，L4 －4，L5 －3，L5 －4，L5 －6，L6 －2，L6 －4，L6－5，本实验室分离并保藏;乳酸标准品(色谱纯)，美国Supelco公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

E2695型高效液相色谱仪，美国 Waters公司;L8000型全自动氨基酸分析仪，上海沪西分析仪器厂有限公司;TA.XT.Plus型质构仪，英国Stable Micro Systems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 豆乳的配制

以5%NaHCO3浸泡大豆2 h，再用60℃蒸馏水磨浆后去渣，调整豆水比为1:8制成豆浆，配制10%(m/V)脱脂奶粉复原牛乳，豆浆和牛乳按9∶1比例混合，添加8%的白砂糖(m/V)，制成豆乳原液，分装于三角瓶内，115℃灭菌20 min，冷却至常温备用。

1.2.2 连续转接实验

将处于对数生长期的乳酸菌菌液按5%比例转接到豆乳原液中37℃发酵。凝乳后记录凝乳时间，达发酵终点后按5%在接种到新的豆乳原液中，如此反复转接7次，观察凝乳状态和酸度变化情况。

1.2.3 菌种的驯化

将菌种分别接种到含等量牛乳和豆乳的培养液中，在37℃条件下连续传代培养5次，再传至牛乳和豆乳比例为4∶6的培养液中，依次降低牛乳的比例，如此连续传代，直至牛乳和豆乳的比例为1∶9，使菌种适应在豆乳中的生长，达到驯化目的。在传代过程中要随时观察，如发现菌体形态明显变化、凝乳状态不佳、乳清析出增加、菌数减少、产酸下降等情况时，说明菌种退化，应及时进行复壮，使其达到稳定状态后，再继续传代驯化，直至该菌株正常生长，完全适应为止。

1.2.4 发酵指标测定

酸度测定:以吉尔涅尔度°T为酸度测定指标，按GB5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》的方法测定。

后酸化能力测定:将到达发酵终点的酸豆乳放入4℃冰箱冷藏，测定酸乳冷藏1、7、14及21 d后的酸度变化情况及活菌数变化情况。

活菌数的测定:将发酵样品用灭菌生理盐水梯度稀释至一定倍数后，采用MRS琼脂培养基平板倾注法，37℃培养48 h后菌落计数，计算各菌株活菌数。

保水性测定参考蔡自建等的方法［11］:离心管重W0放入样品后重W1，3 000 r/min离心30 min，静置10 min后去除上清液，此时重量为W2。保水率计算公式为:

1.2.5 单因素实验

菌种配比(V/V):用于混合发酵2种菌的种子液(在豆乳中37℃培养12 h得到)分别以2∶3、1∶1和3∶2的比例进行复配发酵。以酸度变化情况，综合感官评定来筛选菌种配比。

接种量(V/V):菌株配比确定后，分别按2%、3%、4%、5%及6%的接种量接种，37℃发酵12 h，测定发酵乳滴定酸度，并进行感官评定和活菌数计数来确定接种量。

发酵温度:为研究发酵温度对酸豆乳感官品质的影响，按照菌种配比1∶1，接种量为5%，选择28、30、37、42℃，发酵时间12 h，4℃后熟24 h后进行感官品质评定，以此结果来确定发酵温度。

发酵时间:按照菌种配比1∶1，以5%的接种量，37 ℃恒温发酵，分别测定发酵 6、8、10、12、14 h 后成品的酸度值，确定酸豆乳发酵时间。

1.2.6 感官指标检测方法

感官评定方法如下:根据酸奶组织状态、滋味、气味、口感等4项指标综合打分，总分为100分。各项指标评分标准见表1。

表1 发酵乳感官评分标准Table 1 The sense evaluation standard of fermented soymilk

1.2.7 酸豆乳指标测定

1.2.7.1 酸豆乳质构特性测定

酸豆乳的质构参数采用质构仪测定，参考范宇等的方法［12］。硬度、黏附性、弹性、黏聚性、黏度和回弹性等质构参数的定义及表征参考孙彩铃等的方法［13］。

1.2.7.2 酸豆乳氨基酸含量测定

采用氨基酸自动分析仪测定，参照 GB/T 5009.124－2003《食品中氨基酸的测定》中的方法。

1.2.7.3 酸豆乳还原糖含量测定

直接滴定法，参照GB/T 5009.7－2008《食品中还原糖的测定》的方法。

1.2.7.4 酸豆乳粗蛋白含量测定

凯氏定氮法，参照GB/T 5009.5－2010《食品中蛋白质的测定测定》的方法。

1.2.7.5 酸豆乳脂肪含量的测定

盖勃法，参照GB5413.3－2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》的方法。

1.2.7.6 酸豆乳乳酸含量测定

乳酸的测定采用GB/T 5009.157－2003《食品中有机酸的测定》中的高效液相色谱法，在此方法的基础上进行了改进。

流动相配制:精确称取2.721 8 g KH2PO4，以纯水定容到1 L，用1 mol/L的H3PO4调 pH 为2.5，用0.45 μm微孔滤膜过滤，再经超声脱气作为流动相。

色谱条件:Kromasil C18色谱柱 4.6 mm×250 mm;流动相:20 mmol/L的KH2PO4溶液(pH 2.5);流速为0.8 mL/min;柱温为30℃;进样量为10 μL;紫外检测波长为210 nm。

乳酸标准溶液配制:吸取100 μL色谱纯乳酸到10 mL纯水里，制成浓度为12.06 mg/mL的乳酸原液，在此基础上以纯水稀释到2×、4×、10×、20×的不同倍数，以0.45 μm微孔滤膜过滤制成乳酸标准溶液。

样品预处理:取2 mL豆乳以流动相稀释2倍，混匀30 s，离心 (12 000 r/min，10 min)，取上清液用0.45 μm孔径的滤膜过滤即得到待测液。

定性与定量:在相同色谱条件下，将样品色谱图与乳酸标液色谱图对比，根据乳酸出峰的保留时间来定性，以不同浓度标准液色谱图的峰面积积分值与浓度绘制标准曲线，根据样品色谱图峰面积可计算出样品中乳酸的含量。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌的筛选和驯化

2.1.1 转接试验结果

乳酸菌某些重要代谢特征如产酸、黏度等是由质粒所携带的基因控制，菌株在传代过程中可能使这些特征性状丢失［14］，因此，需要对其遗传稳定性进行考察。乳酸菌连续传代7次产酸能力变化见图1。

图1 乳酸菌在豆乳中连续传代产酸能力变化曲线Fig.1 The curve of acid producing ability by LAB during successive fermentation

如图1所示，10株菌转接过程中稳定性不是很好，只有L3－3，L4－4的滴定酸度维持在90°T以上的水平，其他菌株产酸能力较弱，可能是菌株不适合于豆乳发酵，或是没有适应在豆乳中的生长，需要对其进行驯化以适应豆乳发酵体系。

2.1.2 菌株经驯化后试验结果

豆乳与牛乳体系有很大的差别，利用乳酸菌在牛乳中生长较好的特性，采用先将乳酸菌在等量牛乳，豆乳培养体系中连续传代，再逐步降低培养体系中牛乳的方式来驯化乳酸菌［15］，驯化后的发酵指标结果见表2。

表2 乳酸菌发酵豆乳指标测定Table 2 Determination of fermented soymilk index by LAB

经过驯化以后，各菌株的发酵状态均有所改善，产酸能力增强，部分菌株发酵乳组织状态明显变好，综合各项指标判断，选取L3－2、L4－1、L4－4及L6－2进一步发酵特性分析。

2.1.3 四株菌分别用于豆乳发酵研究

分别以5%的接种量接种到灭菌处理的豆乳中37℃恒温发酵10 h，比较酸化能力，后酸化能力以及冷藏期间活菌数的变化情况。如图2所示。

从图2中可以看出，发酵12 h以后，4株菌产酸速率减缓，开始步入稳定期，L4－4产酸能力最强，酸度在90°T以上，而 L3－2，L4－1，L6－2三菌株产酸能力相对较弱，在60～70°T，发酵产品活菌数均在109CFU/mL以上，4℃贮存21 d内酸度变化在10°T以内，活菌数在贮存7 d以内仍然保持较高的活菌数，之后开始下降，这些指标均符合发酵酸奶的基本要求，即酸度在70～110°T内，活菌数106CFU/mL以上，4℃存放保证21 d酸度变化不超过10°T。

图2 四株菌发酵豆乳酸化能力，后酸化能力以及冷藏期间活菌数比较Fig.2 The curve of titratable acidity of fermented soymilk by 4 LAB strains with fermented(A)，storage time(B)and viable count(C)

在4株菌中，L4－4表现出较强的酸化能力，分解作用，并且产生的风味较好，L6－2用于发酵乳组织状态优良，并且后酸化能力较弱，利于酸乳的贮存，考虑将二者进行复配，混合发酵或能起到互相弥补的作用。

2.2 单因素实验

2.2.1 菌种配比

将 L4 －4，L6 －2 进行菌种复配，采用 3∶2、1∶1、2∶3三种复配比例，按总量5%的接种量接种到灭菌豆乳原液中，37℃恒温发酵12 h，比较酸度值以及感官评价指标(表3)，确定最佳配比。

表3 菌株不同配比的酸度及感官评定Table 3 The acidity and sensory evaluation under different mixture of strains

由表3可知，当菌种配比为3∶2时酸度较高，而菌种配比为1∶1时感官指标较好，从酸度和感官评定指标综合判断，2菌株以1∶1的组合配比发酵产酸适宜，且发酵外观良好。

2.2.2 接种量

接种量是生产酸豆乳关键的一步，不仅关系到酸豆乳发酵过程中的酸度，并且对酸豆乳成品的感官状态也有很大影响。因此在文献基础上，选择了2%、3%、4%、5%和6%的接种量，37℃恒温发酵12 h，测定最终发酵产品的活菌数、酸度值，结合感官评定结果，确定接种量的最佳水平。各组酸豆乳达到发酵终点的酸度值、酸豆乳成品的感官评定和活菌数如表4所示。

表4 不同接种量的酸度、感官评定和活菌数比较Table 4 The acidity，sensory evaluation and viable count under different inoculating amounts

由表4可知，当接种量较低时，产酸可能受到抑制且不稳定，导致凝乳不是很好且风味较淡;当接种量较高时，产酸较高，易造成凝乳中蛋白质脱水收缩现象，使乳清析出较多，出现过酸化现象，给发酵乳组织状态和风味带来不良的影响。当接种量为5%时，发酵酸乳在口感，状态上都最好，虽然6%接种量发酵活菌数更多。但综合考虑酸乳感官品质及可接受性，本实验最终确定接种量为5%。

2.2.3 发酵温度

发酵温度对菌种的活性和酸豆乳的风味都有很大影响，并且不同温度发酵组织状态以及后酸化能力都有很大差异。以5%接种量接入豆乳，发酵12 h，感官评价结果见表5。发酵温度为42℃时，产品的风味及组织状态不佳，伴有尖酸味。发酵温度28℃产酸不足，酸味不够。相比之下，37℃发酵产品的组织状态及风味各方面都比较好，因此确定37℃作为发酵温度。

表5 不同发酵温度时发酵酸乳组织状态Table 5 The quality of fermented soymilk under different fermentation temperature

2.2.4 发酵时间

发酵时间对乳酸菌增殖与产酸影响极为重要。时间过短，则酸豆乳组织不够坚实，风味不佳;时间过长，酸度过高，乳清过量析出，风味也不佳。以5%的接种量，37℃下恒温发酵，分别测定发酵8、10、12、14和16 h后的酸度值，并结合感官评定结果，确定酸豆乳发酵的时间。发酵终点酸度值见图3。

图3 不同发酵时间酸奶酸度值的变化Fig.3 Change of fermented soymilk’s acidity with different fermentation time

如图3所示，随着发酵时间延长，酸豆乳的酸度也随之升高;当发酵12 h时，酸度升高的趋势明显变平缓，这是因为当发酵到8～12 h时，乳酸菌增殖较快，菌活力很强，产酸速率高;而当发酵时间达到10～16 h的范围时，乳酸菌的生长繁殖达到稳定期，且豆乳已凝乳成型，随着发酵的继续进行，开始有乳清不断析出，过酸化现象出现。因此，确定发酵时间为12 h。

2.3 混合发酵和单菌株发酵的比较

2.3.1 混合发酵和单菌株发酵酸豆乳外观及质构特性的比较

单因素试验得到的发酵条件为:菌株配比为1∶1，接种量5%，发酵温度37℃，发酵时间12 h。因为37℃是很多病原菌的最适温度，为了避免病原菌的污染，本实验采用35℃进行酸豆乳发酵，并与2菌株单独发酵时进行比较，质构特性分析数据见表6。

表6 发酵酸豆乳质构特性分析Table 6 TPA index analysis of fermented soymilk

比较发酵外观发现，L4－4发酵乳有部分乳清析出，凝乳不结实，而L6－2发酵乳组织状态良好，无乳清析出，2菌株混合发酵乳的组织状态比L4－4发酵乳明显改善，无乳清析出，贴壁良好;从发酵乳的质构特性(表6)来看，L6－2发酵乳各项质构测试指标都显示出其具有良好的质构特性，而混合发酵酸豆乳在组织状态、硬度、黏附性和黏度等指标也都明显高于L4－4发酵乳，说明经过菌种复配起到了改善L4－4单独发酵乳组织状态的作用。

2.3.2 混合菌株和单菌株发酵酸豆乳营养指标比较以L4－4，L6－2混合菌株发酵酸豆乳，并与2菌株单独发酵酸豆乳中的粗蛋白、还原糖、粗脂肪和乳酸的含量进行比较，结果如表7。

表7 单菌株和混合菌株发酵豆乳营养指标比较Table 7 Nutrition index of fermented soybean milk by L4－4，L6－2 and mix

由于磨浆时豆水比选择的不同，发酵酸豆乳中蛋白质，脂肪等的含量也各不相同，目前还没有一个专门的标准来规定酸豆乳的营养成分含量，所以本研究仅从乳酸菌分解作用的角度出发，比较了发酵酸豆乳和豆浆原液中各种营养成分的变化，从表7可以看出，3种发酵酸豆乳中还原糖明显增加，而脂肪的含量的减少，说明经乳酸菌发酵以后，多糖类物质部分被分解为单糖，而脂肪则被分解为游离脂肪酸或是挥发性脂肪酸，表明本研究中采用的乳酸菌具有一定的分解作用，用于发酵酸豆乳有助于营养物质的细化，更利于人体吸收。混合发酵酸豆乳中还原糖、乳酸的含量高于L6－2，而脂肪含量低于L6－2，说明混合发酵对营养物质的细化作用好于L6－2。

2.3.3 游离氨基酸分析

大豆经加水磨浆稀释后，氨基酸总量降低，但其中蛋白质所含必需氨基酸的种类、含量和比例不变，大豆蛋白氨基酸组成是植物性食物中最理想的、最接近人体所需比例的［16］，只是含硫氨基酸(蛋氨酸、胱氨酸)的含量略低(为大豆蛋白质的第一限制氨基酸)。本实验采用添加脱脂乳到豆浆里作为发酵基质，一方面是为乳酸菌生长提供一些特定的营养物质，另一方面在氨基酸组成上弥补了大豆中某些必需氨基酸的不足。游离氨基酸含量见表8。

表8 样品的氨基酸成分Table 8 The amino acid composition of samples

经不同种乳酸菌发酵，其产生的代谢酶类不一样，对蛋白质的分解作用也各不一致，氨基酸类别和组成也会发生改变。由表8可以看出，发酵乳中游离氨基酸的总量经L4－4发酵后增加了6.749 9 mg/100mL，并且必需氨基酸的含量也有所增加;而L6－2发酵乳游离氨基酸含量较原液降低，主要是因为发酵乳杆菌L6－2为精氨酸产氨试验阳性;混合发酵乳较豆浆原液也增加了3.941 2 mg/100mL，综合表7中还原糖和脂肪含量的变化，发现L4－4菌株的分解作用较强，L6－2分解作用较弱，2菌株混合发酵弥补了L6－2分解作用较弱的劣势。

3 结论

本文从10株乳酸菌中驯化筛选出干酪乳杆菌L4－4和发酵乳杆菌L6－2进行混合发酵制备酸豆乳，并以菌种配比、接种量、发酵温度和时间做单因素实验，得出混合发酵的工艺条件:菌株配比为1∶1，接种比例为5%，发酵时间12 h，发酵温度为37℃。对混合发酵和单菌株发酵的酸豆乳进行比较，结果表明，混合发酵的酸豆乳组织状态优良，硬度、黏附性和黏度等指标明显优于L4－4单菌株发酵;营养成分方面，混合发酵酸豆乳的还原糖、乳酸和氨基酸的含量高于L6－2单菌株发酵，而脂肪含量低于L6－2单菌株发酵，说明混合发酵对营养物质的细化作用好于L6－2单菌株发酵;混合发酵综合了2株菌的优点，有望应用于实际生产。

［1］ Wang Y C，You R C，Yang H Y，et al.Growth and survival of bifidobacteria and lactic acid bacteria during the fermentation and storage of cultured soymilk drinks［J］.Food Microbiology，2002，19(5):501－508.

［2］ 董喜梅，包艳，张勇，等.国内外发酵豆乳研究发展现状［J］.大豆科学，2010，29(5):883－888.

［3］ 李程程，陈晓红，姜梅，等.一株产黏植物乳杆菌发酵豆乳条件优化［J］.食品科学，2010，31(17):201－205.

［4］ Shahabbaspour Z，Mortazavian A M，Pourahmad R，et al.The effects of ratio of cow＇s milk to soymilk，probiotic strain and fruit concentrate on qualitative aspects of probiotic flavoured fermented drinks［J］.International Journal of Dairy Technology，2013，66(1):135 －144.

［5］ 张佳，马永昆，崔凤杰，等.乳酸菌发酵酸豆乳香气成分分析及评价［J］.食品科学，2010，31(20):298－302.

［6］ 徐寅，黄玉军，顾瑞霞，等.乳酸菌对发酵豆乳风味成分的影响［J］.食品与发酵工业，2012，38(5):91－95.

［7］ Chien H L，Huang H Y，Chou C C.Transformation of isoflavone phytoestrogens during the fermentation of soymilk with lactic acid bacteria and bifidobacteria［J］.Food Microbiology，2006，23(8):772 －778.

［8］ Chun J，Kim J S，Kim J H.Enrichment of isoflavoneaglycones in soymilk by fermentation with single and mixed cultures of Streptococcus infantarius 12 and Weissella sp.4［J］.Food Chemistry，2008，109(2):278 －284.

［9］ Marazza J A，Nazareno M A，Giori G S，et al.Enhancement of the antioxidant capacity of soymilk by fermentation with Lactobacillus rhamnosus［J］.Journal of Functional Foods，2012，4(3):594 －601.

［10］ Lai L R，Hsieh S C，Huang，H Y，et al.Effect of lactic fermentation on the total phenolic，saponin and phytic acid contents as well as anti-colon cancer cell proliferation activity of soymilk［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，115(5):552 －556.

［11］ 蔡自建，刘鲁蜀，陈炼红.强化乳清浓缩蛋白对酸奶品质影响的研究［J］.西南民族大学学报(自然科学版)，2012，38(2):242 －246.

［12］ 范宇，陈历俊，赵常新.酸乳低温储存期间乳蛋白和游离氨基酸变化及质构关系［J］.中国乳品工业，2009，37(10):15 －19.

［13］ 孙彩玲，田纪春，张永祥.TPA质构分析模式在食品研究中的应用［J］.实验科学与技术，2007，5(2):1－4.

［14］ Mckay L L，Baldwin K A.Applications for biotechnology:present and future improvements in lactic acid bacteria［J］.FEMS microbiology reviews，1990，7(1 － 2):3 －14.

［15］ 崔树勇.乳酸菌发酵豆奶饮料的开发及生产研究［D］.无锡:江南大学，2009.

［16］ 罗薇，李晓东，张福军，等.大豆分离蛋白在乳制品中的应用［J］. 中国乳品工业，2007，35(6):62－64.