黑蒜中呈色物质5-羟甲基糠醛的分离鉴定及其生成动力学*

卜利伟，邱瑞霞，黄雪松

(暨南大学食品科学与工程系，广东广州，510632)

黑蒜(black garlic)是在控制环境中温度和湿度的情况下，新鲜大蒜(Allium sativum L.)自然发酵而成的产品［1］。在黑蒜加工过程中，新鲜大蒜先在低温条件下熟化一定时间后，再高温熟化成最终产品，其中低温熟化阶段主要发生酶促反应，而高温熟化阶段主要发生非酶褐变反应，包括Maillard反应、焦糖化反应、Vc氧化分解等［2］。这些反应产生的一些褐变产物使黑蒜拥有了相对于新鲜大蒜更加丰富的功能成分和更强的生物活性［3］。而这些反应所产生的一些呈色物质使得新鲜大蒜的颜色从自然白色渐变为黄色、咖啡色到最终的黑色［4］。

成熟的黑蒜兼具黑色和强生物活性，可见黑蒜的呈色物质与品质之间应当存在一定关系，此外，呈色物质本身也有一些生物活性，如类黑精的抗氧化特性［5］，5-HMF可治疗内毒素血症及降低因此诱发的多脏器功能衰竭所致死亡等方面的作用［6］。郭彩华［7］等证实黑酱油中类黑素粗制品对DPPH自由基的清除率最高达89.0%，对羟自由基的清除能力达89.5%，而类黑素正是黑酱油呈色的主要物质。因此，如果了解了黑蒜生产中某种呈现黑色物质的生成规律，便可以利用呈色物质和黑蒜品质之间的函数关系在黑蒜加工的过程中对黑蒜的品质进行监控。为此，本文将对黑蒜中主要呈色物质进行分离鉴定，并通过不同温度等处理研究其生成规律。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

新鲜大蒜，产自山东省金乡县，购自广州市天河区石牌蔬菜市场;购自Dikma公司的色谱纯甲醇;无水乙醇(分析纯)，购自广州化学试剂厂;5-HMF(98.0%)购自 Sigma公司;所有用水均为Mili-Q纯化系统纯化水。

1.2 仪器与设备

FHS-2A可调高速匀浆机，金壇市宏华仪器厂;DHG-9070A烘箱，上海一恒科技有限公司;Prominence LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司;4000 Qtrap四极杆-线性阱复合型质谱仪，美国应用生物系统公司。

1.3 样品前处理

第一阶段:冻结，将样品(3 kg新鲜大蒜分装到100个小袋，每袋30 g)放入－70℃冰箱冷冻48 h。

第二阶段:低温熟化，从－70℃冰箱中取出样品放入45℃恒温烘箱里，熟化72 h，期间每隔8 h取出2袋样品，测定物料中的5-HMF含量。

第三阶段:高温熟化，从低温熟化后的样品中取72袋样品平均放进3个恒温烘箱中，温度分别设定为70，80和90℃，熟化72 h，期间每个烘箱每隔8 h取出2袋样品，测定物料中的5-HMF含量(2袋样品的平均值)。

1.4 黑蒜呈色物质的分离鉴定

将150 g活化后的硅胶装入烧结漏斗中(内径10 cm，长15 cm)。取一定量的黑蒜样品经破碎、离心后，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液旋蒸浓缩至一定体积，然后浓缩液与15 g活化后的硅胶合并在一起浓缩干燥得到硅胶和样品的混合物。将其均匀铺在150 g硅胶表面，以100 mL的石油醚-乙酸乙酯(体积比=1∶1)为初始洗脱液，不断增加初始洗脱液中的甲醇比例来提高极性进行减压洗脱，每100 mL收集一瓶，共收集21瓶洗脱液。

1.5 黑蒜呈色物质的ESI-MS鉴定

将真空柱分离后的第4瓶洗脱液中黑色物质进行ESI-MS鉴定，质谱条件为离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电离方式EI;电子能量70 eV，溶剂延迟时间为2 min，采用正离子模式，扫描质量范围20～500 m/z，采集方式为扫描，质量分析数据库为Nist 9811。

1.6 加5-HMF内标鉴定黑蒜中的呈色物质

将真空柱分离后的第4瓶洗脱液分成2份(1份加入一定浓度的5-HMF标准品，1份不加)，然后用HPLC进行分析。色谱条件为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，检测波长284 nm，柱温40℃，流动相为甲醇∶水(体积比 =10∶90)，流速0.8 ml/min，进样量为 10 μL［8］。

1.7 5-HMF含量测定

1.7.1 5-HMF标准曲线

准确称量0.14 g 5-HMF标准品定容至100 mL，依次稀释为 2.8、11.2、22.4、44.8、89.6、179.2、358.4 mg/L的标准溶液在1.6部分所述色谱条件下进样。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标做线性回归方程y=82 114x－9 699.6，R2=0.998 9(n=7)，检测方法在2.8～358.4 mg/L线性良好。

1.7.2 5-HMF含量测定

将1.3部分不同温度不同加工时间取出的物料切碎、匀浆、离心后加入体积分数80%乙醇，静置12 h后离心去沉淀，然后加入80%乙醇定容至100 mL，静置2 h，吸取一定量上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤后打入进样小瓶中用1.6部分所述色谱条件进行HPLC测定，同时以5-HMF标准品为外标。

2 结果与分析

2.1 黑蒜呈色物质的分离鉴定

根据1.4部分方法洗脱得到了21瓶洗脱液，其中第3瓶洗脱液呈现微黄色，第4瓶［其洗脱液是石V(油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=31∶31∶38］洗脱液挥发完后剩下的物质呈现较重的黑色，将其用一定量乙酸乙酯重溶后做ESI-MS鉴定，图1显示有3个明显的离子峰，其质荷比分别是127、144、149，推测它们分别是 5-HMF(其 M=126)的 M+H+、M+Na+、M+NH4+峰，即图1所代表的样品应当为5-HMF的MS图。

图1 黑蒜呈色物质的质谱鉴定Fig.1 The mass spectrum identification of the color material of black garlic

为进一步确定该洗脱液中的呈色物质为5-HMF，采用1.6部分所述加标方法进行鉴定。图2结果表明，瓶号4样品在加入5-HMF标准品之前，“M”的峰强度约为400 mAU，而加入5-HMF标准品后，其保留时间与未加5-HMF时相同，且“M+HMF”峰的峰强度约为1150 mAU。综合考虑该结果与图1的MS结果，可以得出一个结论:即该洗脱液中呈色物质成分应为5-HMF。黑蒜成熟与否可以通过5-HMF含量来体现，因此，用HPLC测定.3个温度条件下不同加工时期5-HMF的生成含量。

图2 加5-HMF标准品之前和之后对比Fig.2 The comparison of results before and after adding 5-HMF

2.2 黑蒜加工过程中5-HMF的生成规律

2.2.1 5-HMF检测方法的确定

图3－a是5-HMF标准品HPLC图谱，通过配制2.8～358.4 mg/L浓度的5-HMF标准品，用Excel作图得到线性回归方程y=82 114x－9 699.6。图3－b是黑蒜提取物的 HPLC图谱。由图3－b可见，5-HMF在13.87 min出峰，且峰形对称无干扰，可以满足测定黑蒜中5-HMF的要求。

图3 标准品和样品中5-HMF的测定图谱Fig.3 HPLC chromatogram of 5-HMF standard and the sample

将图3－b中对应5-HMF保留时间的峰面积带入上述回归方程中计算出5-HMF的含量，由图4可知，(1)70、80、90℃ 3个温度下加工成的黑蒜产品的5-HMF 含量分别为 4.79、31.28、154.87 μg/g，证明较高温度会促进5-HMF生成。5-HMF是Maillard反应重要的中间产物，其不仅是Maillard反应和非酶褐变的重要指示因子，也是色素沉积的潜在条件［9］。在黑蒜熟化过程的“低温熟化”阶段，物料无5-HMF产生，表明新鲜大蒜本身无5-HMF，并且在45℃低温熟化72 h也没有5-HMF产生，此阶段的生化反应主要是以大蒜中的水解酶类(如大蒜果聚糖水解酶［10］)为主的酶促反应，此阶段的物料颜色由最初的白色逐渐呈现出微黄色。(2)在“高温熟化”阶段的反应主要为非酶褐变反应，5-HMF开始积累，同时物料的颜色开始由黄色迅速变成咖啡色，然后变成最终的黑色，此时得到了成熟黑蒜产品，并显示出黑蒜的各种生理活性和功能特性。(3)3种温度下的5-HMF含量均呈指数增长趋势，用origin8.0软件进一步对数据进行拟合，得到时间与5-HMF含量的函数关系见表1(P ＜0.05)。

图4 5-HMF随着温度和时间的含量变化Fig.4 The variation in content of 5-HMF as the temperature and time

2.2.2 5-HMF生成反应动力学

将加工时间和5-HMF的函数关系用零级反应动力学模型和一级反应动力学模型进行拟合分析发现，其函数关系更符合一级反应动力学方程(表2)。而且C0=1.02 μg/g，速率常数的对数和温度的关系符合方程ln K=－3 862.5(1/T)+7.98，其积分式为K=e7.98exp(－3 862.5/T)= 2.91×103 exp(－32.11/RT)，此方程符合阿雷尼乌斯公式。其中频率因子Kf=2.91×103h－1，反应活化能Ea=32.11 kJ/mol。

表1 5-HMF生成的动力学方程Fig.1 Kinetics of the 5-HMF formation reaction in black garlic

图5 5-HMF生成的阿雷尼乌斯曲线Fig.5 Arrhenius plots for 5-HMF accumulation

陈磊［11］证实黄酒中5-HMF的生成反应也属于一级反应，与本实验结果一致。此外，Fallico［12］研究蜂蜜当中5-HMF的动力学反应时发现，不同种类蜂蜜中5-HMF的反应活化能在32.5～43.6 kJ/mol之间，而本实验测得5-HMF的反应活化能为32.11 kJ/mol，由此可见，在不同的反应体系中，同一种物质的反应活化能会有所不同，陈磊在研究黄酒中5-HMF的生成动力学时证实弱极性物质会促进5-HMF生成。

3 讨论

一般认为，低分子有色化合物和高分子的类黑精是发酵食品显黑色的主要原因，5-HMF属于低分子黑色化合物的一种，在真空硅胶柱纯化收集到的21瓶洗脱液中，除第4瓶洗脱液(主要物质是5-HMF)之外，第20瓶洗脱液，即石油醚-乙酸乙酯-甲醇(体积比=31∶31∶38)洗脱液部分也呈黑色。第20瓶洗脱液的极性大于第4瓶洗脱液极性，因此推测此部分洗脱液有可能是大分子的类黑精。然而由于类黑精成分复杂，无法对其定性定量分析，而5-HMF是一种已知的物质，而且5-HMF的检测方法已经建立，研究其生成规律相对容易，因此，5-HMF用来监控黑蒜的品质更准确和方便。此外，本实验以温度为变量，pH等其他因素对黑蒜中5-HMF生成规律的影响有待进一步研究，不过Fallico等人以温度和pH为变量证实5-HMF生成属于伪一级反应，即当pH固定时，单一以温度为变量，5-HMF的生成属于一级反应。

目前关于5-HMF好坏的报道仍有较大的争议［13－14］，因此，通过应用黑蒜加工过程中 5-HMF 含量和加工时间的动力学模型中的参数可以控制5-HMF的生成含量。

4 结论

本实验分离鉴定出黑蒜中的主要呈色物质之一5-HMF，并通过不同温度条件下的加工，测定不同时期物料的5-HMF含量，发现加工时间和5-HMF含量的函数关系符合一级反应动力学方程，应用于阿雷尼乌斯方程后得到其活化能为32.11 kJ/mol。利用这个动力学模型可以有效控制5-HMF的生成量。例如在黑蒜加工过程中，可以通过低温延长熟化时间来减少5-HMF含量生成，此外，也可以利用该动力学模型可以对黑蒜成熟与否和黑蒜品质做出评判。

［1］ 安东.食品加工工艺的研究［D］.山东:山东农业大学，2011.

［2］ Beveridge T，Franze K，Harrison J.Clarified natural apple juice:production and storage stability of juice and concentrate［J］.Journal of Food Science，1986，51(2):411 －414.

［3］ 雷逢超，郝果，朱黎，等.黑蒜的营养价值及保健作用的研究进展［J］.食品工业科技，2012，33(13):429－432.

［4］ 龚平，阚建全.美拉德反应产物性质的研究进展［J］.食品与发酵工业，2009，35(4):141－146.

［5］ 秦礼康，霄霖.陈窖豆豉粑类黑精组分体外抗氧化活性研究［J］.食品与发酵工业，2006，32(1):88－92.

［6］ 普文英.5-羟甲基糠醛的药物用途［P］.中国，CN1704050.2005－12－07.

［7］ 郭彩华，林丽，陈韶华，等.黑酱油类黑素的提取、光谱性质及功能［J］.食品科学，2012，33(11):89－93.

［8］ 陈磊，黄雪松.高效液相色谱法同时检测黄酒中的5-羟甲基糠醛和9种多酚［J］.分析化学，2010，38(1):133－137.

［9］ Garza S，Ibarz A，Pagan J，et al.Non-enzymatic browning in peach puree during heating［J］.Food research international，1999，32(5):335 －343.

［10］ CHEN Lei，HUANG Huahong，LIU Wenbao，et al.Kinetics of the 5-Hydroxymethylfurfural Formation Reaction in Chinese Rice Wine［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry.2010，58(6):3 507－3 511.

［11］ Cheong K，Yan Fengchao，Huang Xuesong，et al.Enymologic characterization of garlic fructan exohydrolase［J］.Journal of Food Biochemistry.2012，36(2):248 －253.

［12］ Fallico B，Zappala M，Arena E，et al.Effects of conditioning on HMF content in unifloral honeys［J］，Food Chemistry，2004，85(2):305－313.

［13］ 赵玲，张兰，李雅莉，等.5-羟甲基糠醛对脑缺血再灌注模型小鼠学习记忆及脑部自由基的影响［J］.中国药房，2007，18(13):974－976.

［14］ Durling L，Busk L，Hellman B.Evaluation of the DNA damaging effect of the heat-induced food toxicant 5-hydroxymethylfurfural(HMF)in various cell lines with different activities of sulfotransferases［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47(4):880－884.