复合免疫亲和柱净化－液相色谱－串联质谱法同时测定动物源性食品中6种玉米赤霉醇类化合物和氯霉素残留量

王 清， 王国民， 郗存显， 李贤良， 陈冬东，唐柏彬， 张 雷， 赵 华＊

（1.重庆医科大学药学院，重庆400016；2.重庆出入境检验检疫局，重庆市进出口食品安全工程技术研究中心，重庆400020；3.中国检验检疫科学研究院，北京100123）

玉米赤霉醇类化合物（zeranols，ZER）是由多种镰刀霉菌产生的非甾体同化激素，包括玉米赤霉烯酮（ZON）、α－玉米赤霉醇（α－ZAL）、β－玉米赤霉醇（β－ZAL）、α－玉米赤霉烯醇（α－ZOL）、β－玉米赤霉烯醇（β－ZOL）和玉米赤霉酮（ZAN）等，具有促进蛋白质合成的作用，曾被用作家畜促增长剂［1］。氯霉素（CAP）是一种广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有良好的抑制作用，曾广泛应用于动物细菌感染的临床治疗。研究表明，ZER具有生殖毒性、免疫毒性和基因毒性等毒副作用［2］，CAP具有抑制骨髓造血、灰婴综合征、神经毒性等毒副作用［3，4］。在动物源性食品中残留的ZER和CAP可通过食物链对人类的健康构成潜在危害。我国农业部第235号公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》中明确规定，在动物源性食品中不得检出CAP和ZER［5］。

液相色谱－串联质谱法（LC－MS／MS）具有高的选择性和灵敏度，被广泛应用于动物源性食品中真菌毒素和兽药的残留检测［6，7］。但动物源性食品的基质非常复杂，如果不经过净化去除基质影响，会影响LC－MS／MS的准确性和灵敏度。样品前处理净化技术主要有液－液萃取和固相萃取，但两者均耗费试剂，操作步骤繁琐且专属性差。免疫亲和柱（IAC）作为一种优良的前处理技术，具有良好的专属性和高富集性，被广泛应用于真菌毒素和兽药的残留分析［8，9］。针对ZER或者CAP净化的免疫亲和柱，只单一的包含了ZER或者CAP的抗体，不能同时净化富集同一样品中的ZER和CAP；而复合免疫亲和柱（IAC－CZ柱）同时包含了ZER和CAP抗体，能同时对ZER和CAP进行富集净化，从而提高了样品中ZER和CAP的检测效率。本文建立了采用IAC－CZ柱净化、LC－MS／MS同时检测鱼肉、猪肝、牛奶、蜂蜜中ZER和CAP残留的方法，对同时检测动物源性食品中的ZER和CAP具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC－20A液相色谱仪（日本Shimadzu公司）和API4000串联质谱仪（美国AB公司）；XH－B型振荡器（江苏康健医疗用品有限公司）；3－30K台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；ZHWY－2112B恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）；N－EVAP 116氮气吹干仪（美国Organomation Associates公司）；Milli－Q超纯水系统（美国 Millipore公司）。

IAC－CZ柱（柱容量100 ng，3 mL，北京中检维康技术有限公司；4℃冰箱中保存）；HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL，美国Supelco公司）；C18固相萃取柱（1.0 g，6 mL，美国Supelco公司）；NH2固相萃取柱（500 mg，3 mL，美国Supelco公司）；MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL，美国 Waters公司）；β－葡萄糖苷酸／硫酯酸复合酶（美国Sigma公司）；乙腈、甲醇、叔丁基甲醚、乙醚、乙酸乙酯等试剂为色谱纯，氢氧化钠、乙酸钠、氯化钾等试剂为分析纯；实验用水均为超纯水。

α－玉米赤霉醇、β－玉米赤霉醇、α－玉米赤霉烯醇、β－玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮标准品，纯度≥98.0%，购自美国Sigma公司。氯霉素标准品，纯度≥98.5%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

鱼肉、猪肝、牛奶、蜂蜜等样品购自当地超市。

1.2 溶液的配制

标准曲线溶液和基质曲线溶液：用甲醇配制ZER和CAP的单标准储备液，质量浓度均为100 mg／L，于－18℃下保存。用25%乙腈水溶液将ZER和CAP标准储备液稀释成质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0μg／L（ZER）和 CAP为0.1、0.25、0.5、2.5、5.0、25.0μg／L（CAP）的标准曲线溶液。用空白鱼肉（或蜂蜜、牛奶、猪肝）基质溶液稀释标准储备液配制成与标准曲线溶液相同浓度的系列基质曲线溶液。

乙酸钠缓冲液：称取6.80 g乙酸钠，用900 mL超纯水溶解，用冰乙酸调节pH为4.80，定容至1 L。

PBS 溶 液：分 别 称 取 8.00 g NaCl、2.90 g Na2HPO4·12H2O、0.24 g KH2PO4和 0.20 g KCl，用 900 mL 超 纯 水 溶 解，再 用 1.0 mol／L NaOH溶液调节pH为7.40，用水定容至1 L。

1.3 LC－MS／MS条件

色 谱 柱：Shimadzu Shim－pack VP－ODS（150 mm×2.0 mm，5μm）。流动相：A相为乙腈，B相为2 mmol／L 乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）。梯度洗脱程序：0～4.0 min，25%A～75%A；4.0～7.0 min，75%A；7.0～7.5 min，75%A～25%A；7.5～8.0 min，25%A。流速：0.30 mL／min；柱温：40℃；进样量：10μL。

质谱条件：电喷雾负离子－多反应监测（ESI－－MRM）模式检测；电喷雾电压：－4.5 kV；雾化气压力：0.24 MPa；气帘气压力：0.28 MPa；辅助气压力：0.41 MPa；离子源温度：550℃；其他主要质谱条件见表1。

表1 ZER和CAP测定的主要质谱条件Table 1 Main mass spectrometric conditions for the determination of ZER and CAP

1.4 供试品制备

1.4.1 样品的提取

鱼肉、蜂蜜、猪肝：准确称取匀浆后的样品5.00 g于50 mL具塞离心管中，加入10.0 mL乙酸钠缓冲液和50μLβ－葡萄糖苷酸／硫酸酯复合酶，涡旋混匀；置于37℃恒温振荡器（转速为100 r／min）中酶解16 h，冷却至室温后，用20.0 mL乙醚振荡提取30 min，于 5 000 r／min下离心5 min，将上层乙醚液转移至另一离心管中。余下水层中加入100μL1 mol／L NaOH溶液，混匀，用20.0 mL乙醚重复提取1次。合并提取液，于40℃下用氮气吹干，残渣用1.0 mL 50%乙腈水溶液复溶，用0.22μm滤膜过滤（若溶液浑浊，可于5 000 r／min下离心3 min后再过滤）。取滤液0.5 mL，用PBS稀释至5 mL，混匀，待净化。

牛奶：准确称取匀浆后样品5.00 g于50 mL具塞离心管中，加入10.0 mL乙酸钠缓冲液和50μL β－葡萄糖苷酸／硫酸酯复合酶，涡旋混匀；置于37℃恒温振荡器（转速为100 r／min）中酶解16 h，冷却至室温，加入5.0 g NaCl，涡旋混匀后，用20.0 mL乙醚振荡提取30 min，于 7 000 r／min 下离心10 min，剩余操作同上。

1.4.2 IAC－CZ柱净化

将待净化液通过IAC－CZ柱，用5.0 mL PBS和5.0 mL水淋洗，抽干。用2.0 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气挥干，用1.0 mL 25%乙腈水溶液溶解并过滤（0.22μm有机滤膜），滤液供LC－MS／MS分析。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 溶液pH对提取效率的影响

据报道，ZER在弱酸性及中性条件下易溶于有机溶剂［10］，而CAP在弱碱条件下能得到较好的提取效果［11］。在pH4.8时，ZER的提取效率≥90%，而CAP的提取效率仅为50%～70%。当pH为7.5±0.5时，CAP的回收率≥95%。本实验采用调节下层水溶液pH的方法，经两步提取，可最大限度地提取基质中的ZER和CAP。

2.1.2 提取溶剂的选择

本实验考察了乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯和乙腈对几种基质中ZER和CAP的同时提取效率。称取肝脏、蜂蜜、鱼肉等空白基质，分别添加10μg／kg的混合标准溶液，再分别以乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯和乙腈为提取溶剂，按1.4节处理，结果（见表2）表明乙醚的提取效果较好，在不同基质中ZER和CAP的回收率均在90%以上。因此实验选择乙醚作为提取溶剂。

2.2 IAC－CZ柱净化条件的优化

2.2.1 过滤不溶性杂质

以乙醚作为提取溶剂时会同时提取出部分杂质。提取液吹干后，用1 mL 50%乙腈溶液溶解残渣，乙腈溶液中含有大颗粒的不溶性杂质，这些大颗粒杂质进入色谱柱容易堵塞柱，阻碍分析物与特异性抗体相结合，影响IAC－CZ柱的净化效果，对IAC－CZ柱的寿命也有一定的影响。因此，本实验采用0.22μm的滤膜过滤乙腈溶液，可有效减少大颗粒杂质对IAC－CZ柱净化过程的干扰。

表2 不同溶剂对基质中ZER和CAP的提取回收率Table 2 Extraction recoveries of ZER and CAP in matrices with different solvents

2.2.2 上载溶液中乙腈含量的考察

本实验考察了上载溶液中乙腈含量对IAC－CZ柱富集效果的影响。当乙腈含量≤10%时，ZER和CAP的回收率无明显差别（见图1），免疫亲和柱中抗体和分析物的特异性结合作用不受影响。因此，上载溶液中乙腈的含量控制在5%。

图1 上载溶液乙腈含量对IAC－CZ柱富集作用的影响Fig.1 Effect of acetonitrile content in loading solution on the enrichment function of IAC－CZ column

2.2.3 淋洗液和洗脱液的考察

淋洗液选用5 mL PBS溶液和5 mL水，PBS溶液有助于洗脱上载溶液中的非特异性杂质，水可以洗脱非特异性杂质以及PBS溶液中的盐。淋洗过程中无目标物被洗脱。

为确保目标物完全洗脱，本实验考察了洗脱液甲醇的体积对洗脱率的影响。结果见图2，随着洗脱液甲醇体积的增加，洗脱率提高，当甲醇体积达到2 mL及以上时，洗脱率趋于稳定。因此本方法采用2 mL甲醇洗脱。

图2 甲醇体积对目标物洗脱率的影响Fig.2 Effect of methanol volume on the elution rates of the analytes

2.3 IAC－CZ柱与其他净化柱净化能力的比较

常用于ZER或CAP净化的固相萃取柱（SPE）有 HLB 柱［12，13］、NH2柱［14，15］、C18柱［16，17］、MCX柱［18，19］等。本文比较了常用的 SPE 柱与IAC－CZ柱对ZER和CAP的净化效果。称取鱼肉基质加入5.0μg／kg 的混合标准溶液后，按照1.4.1节提取，分别在不净化、固相萃取柱净化、IAC－CZ净化处理提取液后，用LC－MS／MS测定。实验结果见图3（以β－ZAL的LC－MS／MS图为例）。基质样品不经过净化直接过滤后进样分析，基质影响明显，对主成分的测定干扰很大（图3a）；HLB柱、NH2柱、C18柱、MCX柱有一定的净化能力，但基质干扰还是非常明显（图3b～3e）；IAC－CZ具有良好的净化效果，能有效减小基质影响，LC－MS／MS谱图中基线稳定，主成分峰不受干扰（图3f）。基于特异性生物反应原理的免疫亲和柱净化方法越来越广泛地用于ZER或 CAP 的 残 留 分 析［11，13］，本 文 使 用IAC－CZ柱同时富集ZER和CAP，净化效果良好，适合ZER和CAP的残留分析。

图3 （a）未经净化和经（b）MCX、（c）HLB、（d）C18、（e）NH2 和（f）IAC－CZ柱净化的鱼肉基质中β－ZAL的 LC－MS／MS谱图Fig.3 LC－MS／MS chromatograms ofβ－ZAL in the fish matrix（a）without clean－up and cleaned－up by（b）MCX，（c）HLB，（d）C18，（e）NH2and（f）IAC－CZ cartridges

2.4 线性方程、检出限、定量限和基质效应评价

取1.2节中标准曲线溶液和各基质曲线溶液进样分析，以定量离子对的响应值为y，以质量浓度为x作线性回归，考察标准溶液曲线和各基质曲线的线性范围、相关系数及仪器的检出限和定量限，结果见表3。可见标准曲线的R2≥0.999 0，各基质曲线的R2≥0.998 0，表明标准曲线与各基质曲线的线性范围良好。信噪比为3或10时，分别得出仪器检出限为0.04～0.10μg／kg，定量限为0.10～0.40 μg／kg。

基质效应用基质曲线与标准曲线的斜率比值（SSE）来评价［20，21］。SSE为90.8%～108.0%，表示基质效应不明显，说明经过IAC－CZ柱净化后，基质对目标物的测定无明显干扰，可以用外标法定量。

表3 各分析物的线性方程、相关系数、检出限、定量限和基质效应Table 3 Linear equations，correlation coefficients，limits of detection（LODs），limits of quantification（LOQs）and matrix effects（SSEs）of the analytes

表3 （续）Table 3 （Continued）

2.5 回收率和精密度

称取空白鱼肉（或蜂蜜、牛奶、猪肝）样品，分别添加低、中、高水平的混合标准溶液，涡旋混匀后，按照1.4节处理后测定，每个添加水平重复6次，外标法定量，计算平均回收率和精密度。由表4可知，7种分析物的平均回收率在70.9%～95.6%之间，RSD在2.0%～11.8%之间，表明该方法的回收率和精密度均良好。

表4 空白基质中各分析物的加标回收率和精密度（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of the analytes spiked in blank samples（n＝6）

3 结论

本文利用复合免疫亲和柱同时净化富集样品中的ZER和CAP，建立了针对ZER和CAP残留的LC－MS／MS定量分析方法。该复合免疫亲和柱具有独特的专属性和良好的净化效能，可有效地富集不同基质中的ZER和CAP，最大程度地消除基质对分析的干扰。LC－MS／MS分析方法灵敏度高，分析结果可靠，分析时间短，提高了残留检验工作的效率。本方法具有良好的回收率和精密度，分析方法稳定。该方法对不同基质均有良好的适用性，具有良好的应用前景。

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