Cyclin B1基因在大鼠肝癌组织中的表达及意义

秦 虹，欧 超，曹 骥，苏建家，李 媛，杨 春

(1广西壮族自治区肿瘤防治研究所实验研究部，南宁530021;2广西医科大学研究生学院)

细胞周期调控与肿瘤的发生、发展密切相关，其异常对肿瘤形成有重要作用［1］。近年研究发现，Cyclin B1异常表达与多系统常见肿瘤的分级分化、浸润转移及复发有关［2～5］，对肿瘤的恶性生物学行为及预后有重要意义。我们前期研究提示Cyclin B1基因可能是肝癌发生、发展中起关键作用的基因之一［6］。为探讨Cyclin B1基因可能在肝癌组织中的表达及意义，2010～2013年，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar雄性大鼠70只，4周龄，体质量40～60 g，购自广西医科大学动物实验中心。SYBR Premix Ex TaqTM购自TaKaRa，多克隆兔抗Cyclin B1(ab2949)购自Abcam公司，单克隆鼠抗GAPDH购自北京中杉金桥公司，Dylight 680荧光羊抗兔和羊抗鼠二抗购自LI-COR公司，Super PicTureTm Polymer通用型二抗购自Invitrogen公司。实时荧光定量PCR仪为ABI prismor 7900 HT，红外荧光成像仪Odyssey购自LI-COR公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及标本处理 按大鼠体质量大小，随机分为实验组50只，腹腔注射黄曲霉毒素B1(AFB1);对照组20只，腹腔注射等量溶媒 DMSO［7，8］。实验第 13、33、53 周进行大鼠肝活检，第 73周处死两组大鼠并取肝组织。第73周实验结束时，实验组经病理组织学检查确认为肝癌15只，肝癌发生率为30%(15/50);对照组无肿瘤发生。选择实验组15只成癌大鼠与对照组10只大鼠第13、33、53、73周的肝组织标本进行研究，两组肝组织标本部分用液氮速冻保存，部分用中性甲醛固定、常规脱水包埋。

1.2.2 肝组织Cyclin B1 mRNA表达检测 采用QPCR技术检测。用 Trizol试剂提取大鼠肝组织RNA，A260/A280值1.8 ～2.0 为合格，以1%琼脂糖凝胶电泳检测所得总RNA的完整性。选取完整的mRNA，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA溶液。Cyclin B1的上、下游引物序列分别为:5'-TTGTGTGCCCAAGAAGATGCT-3'和5'-TCCATCTGTCTGATTTGGTGCTT-3'，GAPDH上、下游引物序列分别为:5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3'和5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3'。按荧光定量试剂盒说明书进行PCR扩增，反应结束后获取 Ct值，以2-ΔΔCt法计算目的基因Cyclin B1的相对表达水平，并根据溶解曲线判断产物的纯度。

1.2.3 肝组织 Cyclin B1蛋白表达检测 采用Western blot法检测。用常规方法提取大鼠肝组织总蛋白，用BCA试剂盒行蛋白测定，加入上样缓冲液煮沸变性，以GADPH为内参，行10%SDS-PAGE，转膜，封闭2 h，一抗4℃培育过夜，荧光二抗常温避光培育1 h，以红外荧光成像仪扫描图像，读取灰度值。计算各只大鼠肝组织标本中的Cyclin B1和GAPDH灰度值比值，作为Cyclin B1蛋白相对表达水平。

1.2.4 Cyclin B1蛋白免疫组化染色 常规脱蜡、水化，高压修复，双氧水阻断内源性过氧化物酶，滴加Cyclin B1抗体于37℃孵育90 min，滴加二抗于37℃孵育30 min，DAB溶液显色，苏木素复染。每批染色均设已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。结果判定:Cyclin B1蛋白以细胞质中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性显色。阳性细胞数＜5%为(-)，阳性细胞数5% ～25%为(+)，阳性细胞数26% ～50%为(++)，阳性细胞数＞50%为(+++)。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，计量资料用±s表示，组间比较用t检验，多组间均数比较用单因素方差分析;计数资料比较用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组不同时间点的肝组织Cyclin B1 mRNA表达水平比较 见表1。

2.2 两组不同时间点的肝组织Cyclin B1蛋白表达水平比较 见表2。

表1 两组不同时间点的肝组织Cyclin B1 mRNA表达水平比较(±s)

表1 两组不同时间点的肝组织Cyclin B1 mRNA表达水平比较(±s)

注:与同组第13、33、53 周比较，*P ＜0.05;与对照组同期比较，ΔP ＜0.05

组别 n Cyclin B1 mRNA 表达第13周 第33周 第53周 第73周实验组 15 1.320 ±0.399 1.539 ±0.789 1.481 ±0.660 3.948 ±0.958*Δ对照组 10 1.160 ±0.680 1.118 ±0.521 1.138 ±0.472 1.089 ±0.434

表2 两组不同时间点的肝组织Cyclin B1蛋白表达水平比较(±s)

表2 两组不同时间点的肝组织Cyclin B1蛋白表达水平比较(±s)

注:与同组第13、33 周比较，*P ＜0.05;与对照组同期比较，ΔP ＜0.05

组别 n Cyclin B1蛋白表达第13周 第33周 第53周 第73周实验组 15 0.335±0.068 0.348 ±0.061 0.418 ±0.108*Δ 0.748±0.137*Δ对照组 10 0.321 ±0.050 0.338 ±0.075 0.327 ±0.098 0.355 ±0.098

2.3 两组不同时间点的肝组织Cyclin B1蛋白免疫组化染色比较 实验组肝组织Cyclin B1蛋白第13、33周(诱癌早期)均呈阴性表达;第53周(出癌前)的阳性率为26.7%(4/15)，其中(+)3 例、(++)1 例;第73周(成癌期)阳性率为66.7%(10/15)，其中(+)、(++)各2例，(+++)6例。对照组各时间点的肝组织Cyclin B1蛋白均呈阴性表达。实验组第53、73周的Cyclin B1蛋白阳性率明显高于对照组，且第53、73周阳性率比较有统计学差异(P均＜0.05)。

3 讨论

Cyclin B1作为细胞周期家族成员，是控制细胞进入G2/M检测点的关键因子［9，10］，其在 G1期表达很低，S期和G2期逐渐升高，G2/M期转变时达到高峰［11，12］。激活的 Cyclin B1/p34cdc2复合物(即成熟促进因子)在M期发挥激酶作用，使一系列的特异性底物发生磷酸化，从而促进有丝分裂进行［13］。王东等［14］应用免疫组化法检测Cyclin B1蛋白在大鼠诱发肝癌过程中的表达，发现在实验大鼠肝细胞增生—硬化期和肝细胞癌变期，其肝组织Cyclin B1蛋白表达均高于正常对照组。本研究发现，肝组织Cyclin B1 mRNA表达早期不明显，第73周时的表达水平明显高于第13、33、53周;但Cyclin B1蛋白在诱癌早期表达变化不大，但至第53周时其表达水平呈增高趋势，在成癌的第73周表达水平最高;提示Cyclin B1蛋白表达异常可能是肝癌发生前的早期事件，可作为诊断早期肝癌的参考标志物之一。为验证Cyclin B1蛋白在肝组织中的表达情况，本研究采用免疫组化技术检测了大鼠肝组织中的Cyclin B1蛋白表达，结果显示其表达变化与Western blot法检测结果一致，本研究结果与文献报道结果相似［13］。提示从 AFB1诱癌开始到肝癌形成期间，Cyclin B1基因是一个不断积累和过表达的过程，直至肝癌发生。

综上所述，Cyclin B1基因与肝癌的发生、发展密切相关，其在诱发性大鼠肝癌模型中表达敏感，在肝癌早期表达逐步升高，且在肝癌组织中明显高表达，其表达强度逐步增强。本研究提示Cyclin B1过表达不但可作为肝癌早期诊断的参考标志物之一，而且可作为评价肝癌及其预后的标志之一，也为肝癌的基因治疗及治疗新靶点提供实验依据。

［1］Williams GH，Stoeber K.The cell cycle and cancer［J］.Pathol，2012，226(2):352-364.

［2］曹骥，卢晓旭，胡艳玲，等.基因富集及Meta分析对影响肝癌发生发展关键基因的筛选［J］.世界华人消化杂志，2012，20(9):754-758.

［3］陈丽珍，史惠蓉.宫颈癌组织中cyclin B1与CDC25B的表达及意义［J］.山东医药，2008，48(43):93-94.

［4］Cooper WA，Kohonen-Corish MR，McCaughan B，et al.Expression and prognostic significance of cyclin B1 and cyclin A in nonsmall cell lung cancer［J］.Histopathology，2009，55(1):28-36.

［5］Dedic N，Jakic J，Kulic A，et al.Prognostic value of proliferation markers expression in breast cancer［J］.Med Oncol，2013，30(2):523.

［6］Nar A，Ozen O，Tutuncu NB，et al.Cyclin A and cyclin B1 overexpression in differentiated thyroid carcinoma［J］.Med Oncol，2012，29(1):294-300.

［7］欧超，郑海平，利基林，等.CYP3A4在黄曲霉毒素B1诱发大鼠肝癌过程中的表达及意义［J］.中国肿瘤临床，2011，38(14):822-824.

［8］郑海平，欧超，曹骥，等.银杏叶提取物对AFB1所致大鼠肝癌基因P16lnk4a mRNA及蛋白表达的影响［J］.中国肿瘤临床，2012，39(15):1069-1072.

［9］Gavet O，Pines J.Progressive activation of cyclin B1-Cdk1 coordinates entry to mitosis［J］.Dev Cell，2010，18(4):533-543.

［10］Yuan J，Yan R，Krämer A，et al.Cyclin B1 depletion inhibits proliferation and induces apoptosis in human tumor cells［J］.Oncogene，2004，23(34):5843-5852.

［11］赵春玲，宋咏梅，樊飞跃，等.细胞周期蛋白cyclin B1与肿瘤［J］.肿瘤，2007，27(4):322-326.

［12］王东，李笑岩，李红星，等.血管内皮生长因子及其受体与Cyclin E-CDK2在肝癌发生发展过程中的表达变化［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2011，20(4):310-312.

［13］Megha T，Lazzi S，Ferrari F，et al.Expression of the G2/M checkpoint regulators cyclin B1 and p34cdc2 in breast cancer:a correlatien with cellular kinetics［J］.Anticancer Research，1999，l9(1A):163-169.

［14］王东，武玉洁，王笑岩，等.Shh、Ptch、Gli1 与 Cyclin B1-CDK1 在肝癌发生发展过程中的改变［J］.中华临床医师杂志，2011，5(17):4997-5002.